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非小细胞肺癌患者中大多数T790M突变都存在于相同的EGFR等位基因上 
研究背景
携带有 T790M和C797S突变的患者会对一代或三代EGFR-TKI药物产生耐药性，之前已有研究表明患者携带的C797S与T790M突变是顺式或反式会对一代和三代TKI药物产生不同的疗效，然而T790M与激活突变之间的等位基因关系还没有很好的描述过。该研究开发了一种基于数字PCR（dPCR）的方法，用于确定两种类型的EGFR突变（T790M和C797S或激活突变）之间的等位基因关系。
研究方法
01患者和标本收集
来自于10例临床样本（其中9例为EGFR-TKI治疗前，1例为EGFR-TKI治疗疾病进展后），通过传统检测方法检测均携带激活突变（19Del或L858R）和T790M突变，具体突变类型为：L858R (n = 5), Ex19del (E746–A750 [nucleotides 2235–2249], n = 2), Ex19del (E746–A750 [nucleotides 2236–2250], n = 1), and Ex19del(other types, n = 2)。其中， 7个临床样本 （5例L858R 和2例Ex19del (E746–A750 [nucleotides 2235–2249],) 以及2例人非小细胞肺癌细胞系样本 (H1975, PC-9-GR)通过dPCR和NGS技术检测EGFR和T790M之间的等位基因关系，另外3例临床样本（携带Ex19del 不同于 E746–A750(nucleotides 2235–2249)仅使用NGS技术检测。如下图1所示：
图1：样本收集及检测技术示意图
02细胞培养和试剂
H1975 (positive for L858R and T790M mutations of EGFR) 和PC-9 (positive for Ex19del [E746–A750, nucleotides 2235–2249])分别来自美国菌种保藏中心和欧洲认证的培养细胞系。 03培养产生对吉非替尼耐药的PC-9子细胞系 研究者通过将PC-9细胞系暴露于浓度为1uM吉非替尼培养基6个月，从而获得了对吉非替尼耐药的携带T790M突变的子细胞系，然后再通过挑选单克隆，最后建立了对吉非替尼耐药的T790M阳性的PC-9-GR细胞系 04构建质粒和设计引物探针 编码野生型(pBabe-EGFR-WT)、19缺失(E746–A750 [nucleotides 2235–2249]) (pBabe-19del)、T790M(pBabe-T790M), 或者 Ex19del + T790M (pBabe-19del + T790M)的人EGFR形式的质粒来自于Addgene。编码L858R (pBabe-L858R) 或者C797S (pBabe-C797S) 的质粒来自pBabe-EGFR-WT ，通过Quick Change Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)试剂盒获得。编码L858R + T790M (pBabe-L858R + T790M) 或者C797S + T790M (pBabe-C797S + T790M) 来自pBabe-T790M。19Del、 L858R 或C797S 突变引物和探针序列如表 S1所示，检测原理如图2。
图2. 基于dPCR技术方评估两种EGFR突变类型之间的关系原理。（A，B）设计的引物和探针来检测激活突变或者C797S（用FAM标记，红色），T790M（用VIC标记，蓝色），A为顺式cis，B为反式trans。（C，D）基于dPCR技术得到的热点图分别表示同时出现19缺失和T790M突变 (pBabe-19del + T790M) 信号的即为顺式， 或者仅有19缺失(pBabe-19del) 或者 T790M (pBabe-T790M)信号即为反式。
05数据分析
将dPCR和NGS的检测结果，通过建立线性回归分析来评估质粒上样量和等位基因数量之间的关系，同样用来评估T790M阳性等位基因数量和激活突变阳性等位基因数量（T/A比例）之间的关系。
研究结果
01 通过对一系列稀释过的pBabe-L858R + T790M 和pBabe-19del + T790M模板结果进行分析，表明质粒上样量和双阳性等位基因数量之间存在线性关系，R值分别为 0.9864 和0.9839，如图3 （A, B） ，同时亦说明等位基因特异dPCR技术非常特异，通过此方法来分析EGFR等位基因双突变是非常可靠的。
图3.基于定量dPCR技术分析EGFR等位基因双突变结果图。（A，B）等位基因双突变的数量与加入pBabe-L858R + T790M (A) 或者 pBabe-19del + T790M (B)的质粒浓度之间的线性关系。（C）等位基因双突变的数量和加入pBabe-C797S + T790M的拷贝数与背景中pBabe-EGFR-WT 5000个拷贝数成反比。（R）为所有数据之间关系的系数
02 以6号临床样本为例（如图4所示），对不同信号的数量通过泊松分布计算后得出，顺式（cis）等位基因双突变的数量占T790M单阳性的比例（C/T）为100%（27/27） 。所有9例临床样本中C/T的比例（如表1所示）， 中位值为97.1%（90%-100%），表明不论T790M突变是de novo还是获得性的突变，几乎所有的T790M突变和激活突变都存在于相同的等位基因上。
图4.来自6号临床患者样本的dPCR结果分析。dPCR实验基于（1）和（2）两个panel。19缺失（红色），T790M（蓝色）和两种突变同时出现（红色和蓝色） 的数量通过系统软件记录下来，再泊松分布计算出来目标等位基因的数量。
03 如图5所示，dPCR和NGS两种技术结果均显示带有de novo T790M突变样本（1号患者和H1975）的T/A比例要比带有获得性耐药的样本的比例更高（dPCR平均 84.2% VS 34.9%，NGS平均 94.7% VS 39.3%） 。
图5. 通过dPCR和NGS检测方法建立的9例临床及细胞系样本中T/A的比例关系。
表1.通过dPCR和NGS技术得到的EGFR中激活突变（AMs）和T790M突变统计值
研究结论 1.本研究开发了一项用于评估激活突变或C797S突变与T790M突变是否位于EGFR相同的等位基因上的可靠的技术方法。 2.通过该方法，研究者发现几乎所有的T790M突变和激活突变都为顺式（cis），不论它是原发的还是获得性的。
知识要点回顾
1.该研究前瞻性的开发了一项基于dPCR技术用于评估激活突变或C797S突变与T790M突变是否位于EGFR相同的等位基因上的可靠的检查方法
2.通过该技术方法，研究者发现几乎所有的T790M突变和激活突变都为顺式（cis），不论该肿瘤由于T790M突变导致的对一代TKI的耐药性是原发地还是获得性的
3.携带T790M与激活突变为顺式突变的肿瘤细胞似乎是在EGFR-TKI的治疗过程中被选择和富集起来的。
参考文献：
Noriko Hidaka. et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele asactivating mutations in patients with non–small cell lung cancer; Lung Cancer 108 (2017) 75–82.
转自：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI1MzU0NTcwNg==&mid=2247483976&idx=1&sn=d53a63f0ffe07e404d7f0bdfcae33a8b&chksm=e9d39fcddea416db2e4164d29950e3bad042c1ff14ce9ba59316bb503be61a9f3e7ba510fc88&mpshare=1&scene=1&srcid=0404lwh2JlUXBkepU4mDY0vJ&pass_ticket=pQ2UyxaBy8lthb3egEi4UsXzghtvE6t3gAsJaxSb3IO8zklkX9jsu%2FzpaSReJ7hG#rd
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