RT-PCR作为一种常用的分子生物学手段，正在科研和临床上得到越来越广泛的应用。但是，和其他的分子生物学实验一样，其实RT-PCR的坑也挺多的。而且，最坑爹的是，导致RT-PCR出问题的原因可能很多很多。有时候，实验失败了，还不知道问题出在哪里。下面，毛博重点分析一下RT-PCR出问题可能的林林总总的原因。

可能原因1：引物问题（包括：引物设计较差，引物合成较差，引物浓度太低）。

解决方法：设计引物的时候，避免在引物3'端含有互补序列；避免可以形成内部发卡结构的序列；设计Tm类似的引物。针对引物合成的问题，用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。

可能原因2：探针问题。

解决办法：就要用到我们前面提到的序列分析了。用blast对探针序列进行比对，设计符合要求的探针。

可能原因3：模板问题（包括：模板质量不好，模板浓度太低）。

解决方法：提高模板质量。如果怀疑模板被DMSO等抑制剂污染了，坚决采用乙醇沉淀；使用104copy的靶序列，然后在25到30个循环中获得信号。

可能原因4：不明物干扰。

解决办法：做RT-PCR必须非常小心翼翼。对RT-PCR的任何实验样品或试剂，均应采用“三无”离心管（即无菌无酶无热源）进行试剂的分装和使用。

可能原因5：扩增酶问题。

解决办法：不要省钱。买好的扩增酶。分子生物学永远是一分价钱一分货。毛博推荐：选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素

可能原因1：引物问题（包括：引物二聚体太多）。

解决方法：检查引物设计环节和合成环节，必要时重新设计和合成引物。

可能原因2：扩增酶问题。

解决办法：选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加特异性。

可能原因3：检测温度太低。

解决办法：在更高的温度下检测荧光信号。这个时候，引物二聚体已经解链。

可能原因1：RNA问题（包括：RNA被损害和降解；初始模板RNA不充分）。

解决方法：如果完全损害或者降解的话，更换RNA；增加模板RNA的浓度；使用10ng-1μg的总RNA。

可能原因2：仪器故障。这个是最坑爹的。

解决方法：检查扩增仪的温度；检查荧光仪器温度和信号。如果发现故障，就赶紧找厂家来修吧。

可能原因3：PCR扩增无效。

解决方法：反转录的抑制剂很多很多，包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺等等。一定要注意，不要被这些抑制剂污染了。

大家也看到了，RT-PCR的坑其实不多。但是，一旦掉坑里，你都不知道为什么。因为可能的原因太多了。最后想说的是，一旦出问题了，不要着急，就一个一个排除吧。这种时候，排除法是最管用的。