阅读一份FISH新产品的说明书时，最让我们关注的便是不同信号的解释和判读阈值的给出。阈值是什么？阈值又叫参考值，是体外诊断试剂的重要指标之一，也是临床使用判断被检测样本是否异常的重要依据。在临床检测中，你是否会因为阈值的建立而感到苦恼？你又是使用哪种方法建立阈值呢？

目前广泛接受的阈值设定标准为：阴性标本5例以上，计算异常信号类型细胞数量，取其平均值再加上三倍标准差【阈值 = 平均值（M）+ 3×标准差（SD）】。我们今天的方法就是建立在这个基础上。现在就请大家跟着小编一起学习阴性阈值的建立方法，试一试建立属于自己实验条件下的阴性阈值吧！

步骤ABC：

A：样本选择：

阴性样本的选择可以根据待检测样本类型进行选择，比如血液类探针，我们可以选择核型检测正常或出现其它（非待检靶标）异常的的外周血或骨髓样本；而对于石蜡包埋的样本可以使用扁桃体组织。

样本数量的选择普遍使用5例以上，理论上选取的的个体数量越大越能代表参考人群。

拿到样本后，按照厂家说明书的要求对样本进行预处理，制备阴性阈值参考片。一般细胞类样本制备成细胞滴片，组织类样本制备成3-5μm组织切片。

小编：样本选择三要素，样本数量大于五，样本类型要相同，制片过程看厂家。

B．信号类型判断

FISH探针的类型多种多样，临床最常见的包括融合探针、断裂探针、计数探针和基因探针。不同探针的检测目的、信号类型和计数中注意点有所区别。

l R红色荧光信号；G绿色荧光信号；F融合荧光信号。

列举一些常见的阳性细胞类型：

1) 融合探针：出现1个及以上融合信号类型的细胞为阳性细胞。

2) 断裂探针：出现至少一组两两信号距离大于单个或更多信号直径的细胞为阳性细胞

3) 计数探针：出现大于2个同种颜色信号或其它异常的细胞为阳性细胞

4) 基因探针：出现至少有一种颜色信号缺失的细胞为缺失阳性细胞；出现大于2个同种颜色信号的细胞为扩增阳性细胞。

其它特殊信号类型：

小编：信号类型要分清，弥散重叠和断裂，镜下识别多比较。

C．计数开始

建议每例参考片至少计数50个细胞，细胞数越多有助于减少误差。如PML/RARA融合基因检测试剂盒计数100-200个细胞。观察每个核内各种颜色信号点或融合信号数目。计算出现FISH阳性细胞的总数及百分比，统计百分比的平均值及标准差，阴性阈值设定为平均值+3倍标准差。

阈值计算原始统计表：

小编：抓住两个核心点，算好平均/标准差，阈值就是A+B。

实例分析：

以建立BCR/ABL（DF）融合基因试剂盒（荧光原位杂交法）【安必平】的阴性阈值为例，帮大家作进一步巩固：

i. 试剂盒介绍：提供两种探针，分别为22q11的BCR（绿色，G）基因探针和9q34的ABL（红色，R）基因位点探针。在90%以上CML、30%成人ALL、2%-10%儿童ALL、以及少数AML和MM的患者中易位形成BCR/ABL和ABL/BCR融合基因，可作为疾病的预后判断、用药疗效、微小病灶残留及移植术后效果监测的一项辅助检测手段。

ii. 参考人群及数量：20例经核型分析确定为非BCR/ABL基因融合的白血病患者。

iii. 细胞数： 200个细胞。

iv. FISH阳性信号类型：

由于信号的随机重叠，出现1R1G1F的比例明显高于其他融合信号类型，所以对1R1G1F单独设定一种阴性阈值，故BCR/ABL（DF）融合基因试剂盒为阴性阈值a和阴性阈值b。

a) 出现1R1G1F融合信号类型的细胞；

b） 出现除1R1G1F外其他融合信号类型的细胞。

v. 阴性阈值计算原始统计表

【3倍标准差法：阈值=平均值（M）+3 x 标准差（SD）】

小编说：跟着我的ABC，建立阈值好轻松。

你们学会了吗？