这两天写一个研究方案，是用二代测序来寻找突变，该方案目的是提高临床诊断率及发表10分以上文章。有兄弟知道了，很吃惊的问我“你人格分裂啦？”。哈哈。这位兄弟有这个反应，其实不奇怪，因为我在讲座中是建议用芯片来筛选差异基因，不是二代测序。咦，那为什么我会出而反而呢。呵呵。再次自我批评下，讲座中可能没有表述清楚。讲座中是以肿瘤为例，肿瘤研究中不建议用二代测序。为什么呢。今天就跟大家聊聊，什么时候用芯片，什么时候用测序。

在疾病研究历史中，发现疾病相关基因，是个非常重要的步骤，因为只有找到相关基因了，也就有可能找到诊断或治疗的靶点了，诊断出来，然后治愈就有希望了。发现疾病相关基因，人类一直在寻找方法。

1、蛋白

生命活动中，最重要的是蛋白。所以分子生物学发展中，先出来的是蛋白技术。所以在疾病研究中，找疾病相关因素，先找的是蛋白。看疾病中有什么蛋白跟正常不一样。这里的不一样，量的差异是最容易的。所以，一开始疾病相关因素的寻找，是寻找表达量不同的蛋白。现在大家都知道的技术，一个是固相二维电泳做质谱。一个是液相二维电泳联合质谱。

但不同的蛋白，性质不一样，分离条件不一样。人的基因现在认为大概20000个左右，但蛋白就不止这些了。一个基因可能有多个转录本，有时一个基因编码的蛋白可以切割成两个甚至三个，比如胰岛素，呵呵。所以蛋白的保守估计超十万以上了。现在最好的差异蛋白分析技术，大家可以去了解下，看分析的量是多少。有人跟我说，最好的是5000个蛋白。呵呵。

所以，通过蛋白来寻找疾病相关基因，就存在这个缺陷，通量不够。

2、基因（表达量）

在发现蛋白是由基因编码的，基因是遗传物质后，大家就转向寻找疾病相关基因了。一样的道理，量是最容易达到的。所以，大家就开始寻找疾病中与正常相比较，哪些基因有表达差异。这个大家知道的就是芯片技术了。人的基因组计划完成好几年了。人的编码基因基本上都清楚了。所以，人的全基因组表达谱芯片上，人的基因都在。注意下，这里的基因是指蛋白编码基因。

在芯片技术一出现，疾病研究就达到长足进展。很多现在临床上治疗用药物的药靶，都是通过芯片技术找到的。

3、基因（突变）

在基因的研究中，测序技术达到了发展。特别是二代测序的发展。发展到现在，一个个体的全基因组测序，所用时间和费用大大降低，这样就给大家研究基因提供了新的技术。研究基因什么呢。呵呵。突变。这里的突变，包括点突变、缺失、扩增、移位。

聊到这里，疾病研究的历史，技术发展历程，大家知道一二了吧。1、寻找差异蛋白，可以。但通量小。2、芯片。通量高。找到的是表达差异基因。3、测序。通量高。找到的是突变的基因。（注意，测序也可以做RNA测序，看表达差异。不过，大家问问测序公司，RNA测序看表达差异，与芯片看表达差异，哪个精度高。呵呵。看看是否说实话。至于说可以找到新的基因，这里指的是非编码基因，大家先看下lncRNA的日志，再评估这个点，别被人忽悠了。）

那么回到我们的问题上，疾病研究中，寻找差异因素，是用芯片呢，还是测序呢。蛋白通量小，就不讨论了。不过大家注意，不是不重要，液相二维电泳联合质谱分析是非常厉害的技术，很重要。遇到具体的研究时，我再跟大家聊这个技术。

芯片，测序，这是个问题（生存，还是死亡，这是个问题，哈哈）。这两个技术平台都是非常好的研究手段，没有好坏之分。但对于特定的研究，就存在是否合适的问题了。

因为芯片和测序技术特点不一样，一个是检测表达差异的基因，一个是检测突变的基因。所以，在疾病研究中就要看，疾病发生，关键因素是表达差异，还是突变。

有不少人反对这句话。说，不管发病因素是什么，最终的体现，都是通过蛋白，或者说，通过效应蛋白来发挥作用。而蛋白是基因编码的。看基因表达差异，肯定没错。这个一方。

另一方说，很多疾病的发生，都是基因上有突变了，然后才导致下游基因的表达改变，最终导致临床表现，所以要找到这些突变。

双方都没有错。呵呵，盲人摸象，角度不同而已。

在疾病研究中，采用芯片还是测序寻找致病因素，要看具体疾病。如果一个疾病，跟遗传没有什么关系，那么就用芯片。如果一个疾病，跟遗传有关系，那么就用测序。当然，用芯片也没有问题。因为，突变后，要产生临床表现，肯定要经过下游基因。（单基因遗传病，由于突变造成基因功能丧失，比如血友病。这类只能用测序。另外，一些酶突变失活，导致疾病的。也是优先用测序。我这两天做讲座太多，很累，没有举具体的例子。如有人有这方面的信息，发给我，我补充到该文章中。谢谢。）

不过要注意，突变，可以作为临床检测的指标，但作为药靶的话，还很遥远。除非是突变导致过度激活，找抑制的药物。如果是突变导致失活，那么就需要补充野生型基因了。这个就是基因治疗。目前进展不是很多，有用cas9加干细胞在研究的。现在的药物，基本上都是针对表达差异的基因，特别是表达高后导致疾病的。找个分子可以抑制该基因，就是药物了。

不知道现在大家是否清楚，该用什么技术来寻找致病因素。最后说说肿瘤。

肿瘤的发生，大家可以看看前面的日志，“肿瘤的传说”。肿瘤其实是体细胞遗传病，必须要有突变才会导致肿瘤。所以，不少人用测序来寻找肿瘤发生的突变。呵呵。而我一直反对这样做。虽然有很多人，找到了肿瘤的相关突变，有很多高分文章。但我还是反对。

为什么呢？因为，肿瘤的一个特性就是恶性增殖，而恶性增殖会导致基因组不稳定。这个是公认的。很容易突变。在早期，起始的几个突变出现后，正常细胞变为肿瘤细胞。在后续的发展中，会有非常多的突变出现。在一个肿瘤病人组织中，同一个肿瘤，不同地方的细胞，突变可能就是不一样的。肿瘤的这个特性，就是其耐药的基础。很多靶向疗法，都出现过这种情况，第一次有效，但复发后就无效了。比如avastin这个靶向药物。原因就是，一开始，通过这个靶点，抑制了肿瘤细胞。但肿瘤细胞中，可能存在很少的细胞，这些细胞中这个靶点或靶点下游是突变的，不受这个靶点控制。在药物作用下，其他肿瘤细胞发生死亡和凋亡，这很少的细胞却能够存活，最终复发的肿瘤，该药物无效。所以靶向治疗，一定要联合其他疗法，比如化疗或放疗。大家注意，现在比较热门的CART治疗，我很赞同从免疫上来治疗肿瘤。不过，需要提醒的是，CART的靶点，也就是CAR的抗体识别的肿瘤抗原，如果有少部分肿瘤细胞存在突变，那么研究的历程跟原先靶向治疗会类似，也会出现复发耐药。呵呵。所以，我估计，CART治疗，如果出现复发无效，最终还是会联合其他疗法的。或者，多个靶点一起上，跟HIV治疗的鸡尾酒疗法一样。

空口说无凭，呵呵。到文献中找依据。2015年4月15日nature上发表文章（MAGI3–AKT3 fusion in breast canceramended.nature.2015.520.7547.），撤回了先前的一篇文章。15日的文章，我没有下到全文。但把前面的文章下载下来了。大家可以看看。（Sequence analysis of mutations and translocations across breastcancer subtypes. Nature.2012.486.7403.）

2012年的这篇nature，就是通过全基因组测序，做了22个病人的测序。发现了突变基因，MAGI3-AKT3融合（7%的样本中出现）。发表了nature。而2015年的文章，发现在随后的扩大样本检测中，却未能检测到该突变类型。

呵呵。我的担心就在这里，肿瘤的突变何其多，就算发现了，证明了。但病人中比例有多少。前几天，有位兄弟跟我说，他认识的一位老师，做了60例测序，花了300多万。什么结果也没有。Sign，要是认识我，找我讨论下，只要方向正确，这些经费，少说也能发个几篇10分以上的呀。肿瘤，建议别做测序。风险太大了。就算发了文章，别人验证不出来，还是要撤稿。不过，如果您手上有几千万经费，样品也有上千份，这个是可以做的。只要突变率在大样本验证中是OK的。即使低，也是有临床意义的。

另外悄悄说一句，不知道是否有领导会看我的文章。很多有水分的文章，临床样品检测和统计，是水分最多的地方。呵呵。老外比较客观，是什么就是什么。发现前面错了，就认错。这个态度，其实是我们要学习的。而实际操作中，最重要的是如何去评估这类数据的真实性和可靠性。