定义

用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学(IHC）技术或免疫细胞化学（ICC）技术。

原理

根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量

免疫组化试验流程

1、  切片3~4um

2、  71℃   13分钟烤片

3、  二甲苯脱蜡2缸    15分钟/每缸×2，梯度（从高到低）酒精2分钟/每缸

4、  PBS清洗3次    3分钟/每次

5、  各种修复方式：高压柠檬酸6.0，高压EDTA9.0 高压锅冒气加阀 3分钟或4分钟，离火自然晾凉

6、  PBS清洗3次    3分钟/每次

7、  3%过氧化氢     10分钟

8、  PBS清洗3次    3分钟/每次

9、 滴加一抗   37℃ 1小时或过夜

10、 PBS清洗3次    5分钟/每次

11、试剂盒迈新S-P或Elivision plus

12、 PBS清洗3次   3分钟/每次

13、 DAB显色      3管DAB(A+B+C)   13分钟     

14、 苏木复染    40秒

15、清水洗干净

16、盐酸酒精分化（4秒）

17、 流水返蓝       15分钟或根据情况

18、吹干、封片

需要注意：

1、切好的切片最好放在4摄氏度左右冰箱里，抗原较不容易丧失。把要做的切片先分好，做几个抗体可分几盒，还有不正常组织与正常组织要分开。其余做预实验用。

2、选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。www.proteinatlas.org

3、试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。

4、关于抗体试剂等购买，可多家比较，尽可能询问详细。最好买下该公司的阳性片。切记尽可能不要先付钱，等预实验成功后再付，还有尽可能节省，因为会有太多你意想不到的情况，都是需要花钱解决的。买的量尽可能一次性到位，能省就省，风险大的尽量不要省。若实验过程有问题，大可尽量与该公司技术部联系，寻求解决方案。若是怀疑抗体质量问题，可要求换货，态度要强硬，协议流程一次到位，不可被对方牵着鼻子走，否则最终结果只能是浪费时间。若是抗体浓缩液，个人觉得国内的应该都可以做出阳性来，不是国内买不到的话，可考虑国产的，可便宜很多。可以的话尽量多咨询老师的看法。

5、思维要紧密，珍惜每次难得的机会，也许机会少了，每次珍惜了，成长的会更快，更不会浪费。（士兵突击，成才）

6、每次开始做时，都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外，并先想好补救措施。防止万一。例子。

7、首次预实验先拿出多张不同的组织切片按最常规的条件进行，若没阳性再拿多张不同组织片（可以与首次相同），条件要适当改进，可先找出一个阳性区域，再深入改进。

8、烤片（单一或综合）程度要适情况而定，可中途拿出甩一甩，尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好，脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。注意温度稳定，再烤片。

9、抗原修复与烤片：温度高低，缓冲系统。

10、二甲苯脱蜡，若是天气太冷，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，同时也可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样会更彻底，效果会更好，若是天气不会太冷，那还是室温下脱蜡，要不可能会适得其反。时间也是适情况而定。

11、脱水与水化。酒精梯度不同。高低相反。原因。

12、甲醛固定会导致蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。高压修复，注意稀释比例，修复液为何种（EDTA不可以重新进行利用，可能发生交叉作用），PH值为多少，还有修复方式（直接修复与间接修复，差别：压力和温度关系），不同方法的修复（水煮，微波）。高压锅内压力未降至正常时不可打开，正常后多放会儿，能更好的利用余压，把握程度。若是多次修复，每次都需先把锅内热水倒掉，换冷水，保证条件的可重复性。水煮法，电磁炉功率800W为佳。不可让水蒸发掉太多，保证组织至始至终不会干掉。功率太高，组织会脱落。

13、做的切片量较多时，冲洗擦片顺序很重要，小心PBS与抗体混合。PBS切勿把组织冲洗掉。量少时，孵育盒内先倒点水，防止孵育箱内抗体被蒸发掉。

14、PBS冲洗是为了保护内环境。PBS的PH值为7.1—7.5. 免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体最适合的pH值为7.2~7.6。PBS酸碱度与离子度高低的关系。

15、切片不可拿反，易把组织擦掉，思考解决方法，利用编号。

16、人经常是死在自己的优势上而不是自己的劣势。举例：擦破切片。

17、组织切片始终报纸湿润，不可让其干燥。不可有泡泡。为什么？原因讲解。

★过氧化氢酶孵育过久，会导致组织脱片。

18、在不确定瓶内为何液体时，建议倒掉重装，若是抗体配模糊了，建议重配。抗体稀释技巧。吹打次数，震荡机运用。抗体、试剂，都应放冰上处理，养成习惯。

★抗体浓度、温度（速度）、时间（反应的量）为IHC三大关键点。

19、抗体反复冻融可使效价降低。抗体要防止污染。不可用塑料保存，塑料可吸附抗体。抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS（其他稀释液，注意PH值，PBS为偏中碱性）稀释的抗体最好要当天使用。稀释比例恰好为佳，注意前带和后带效应。

20、抗体、试剂盒（注意种属来源，一抗为rat，二抗一般不提倡抗mouse\rabbit），必需完全覆盖组织，能省尽量节省抗体，不可太死板。

21、灵敏性和特异性是相互矛盾的，不可兼顾。（单克隆与多克隆）

22、除了抗原修复时间与一抗的孵育条件外，其他因素对实验的结果影响不大，当然试剂与试剂盒不能出现问题，oct-4一抗、试剂盒、DAB都曾出现问题过，故对这些质量有时也要保持一定的怀疑，除非有一定的事实证明不是这些问题。这就需要花一定的时间设计方案进行验证，同时要尽可能应用华罗庚统筹原理设计方案，尽量节省时间。当遇到问题时，需要的是根据已有资料，一步步的分析。考虑各种可能原因。

23、过夜时间一般要达到16-24个小时。还有冰箱的过夜温度对非特异性染色结果影响很大。温度越接近4摄氏度，效果可能越好，但阳性强度可能会下降，程度不大。过夜冰箱拿出后要放置孵育箱半小时或置于室温一定时间（45分钟），一抗再冲洗，冲洗要彻底。一般不考虑室温下孵育，温度不稳定。

24、二抗可能出现交叉反应，通过PBS代替一抗，阴性对照试验可进行排除。

25、DAB显色要适情况而定，太久可能造成非特异性染色强。同时要注意DAB为致癌物质，有必要防护。苏木素染色前，要先把氧化膜捞出，要不组织贴上就废了。若是天气太冷，可先把整罐苏木素放入孵育箱里加热，再染色，最好有盐酸分化，细胞质和细胞核能更好的分清楚。染色最好不要把弱阳性细胞给覆盖了。做的量较多时，分批显色。用有阳性的片先显色。原因讲解。

★细胞核需染色时间较长，细胞浆染色时间较短。

26、染完色后，流水冲洗十分钟很重要，能让细胞镜下形态更好看。

27、吹干封片，封片技巧个人体会讲解，不能有泡泡。若是没封好，可进行二甲苯、酒精脱树胶，吹干再次封片，但镜下效果会明显变差，切记，若没必要，最好不要再次脱胶。标签要贴正，要不会让人笑话。

28、刚封完的载玻片会移动，故还没干看片时，尽量不要碰到盖玻片，可避免树胶溢出，片的整体效果不好。

★DAB显色需用中性树胶封片，AEC（易溶于有机溶剂）需用水性胶封片。

29、预实验阳性片的选择与标准。所选择的阳性片有可能是中阳或弱阳性，故应取最佳效果（即特异性染色与费特异性染色的综合结果）的条件，而不应执着于要有强阳性。

30、实验中遇到问题，要善于查找文献是否有提到类似情况。充分利用文献。也可咨询各大生物公司的技术指导部，或各大论坛寻找方案，求救。如小木虫（http://emuch.net/）、丁香园（http://www.dxy.cn/bbs/index.html）等。

31、抗体不够用的情况下，原先买的抗体最好不要用完，留做可能需要的验证试验。新的抗体要尽量同公司，同批号。

32、对oct-4做出的效果原因猜想，由于部分细胞核未被切开（虽然厚度已为0.3-0.4mm），且抗体本身浓度不够，导致无法对细胞核进行定位，结果部分癌巢为阴性。抗体为工作液，浓度无法改变，故可以考虑对细胞进行细胞通透，促进抗体对细胞核的定位。背景染色不好，个人觉得为抗体纯度不够，或可能对正常组织更敏感。发现DAB显色时，正常组织着色先于癌组织，这为不正常情况。

                                             09病理陈少华  

                                            2012/4/6