来源：生物360

前列腺癌是男性中最常见的癌症。由于前列腺特异性抗原诊断特异性的不足，目前非常需要一种新的互补诊断方法。

miRNA是一类长度约20-24个核苷酸的小RNA，其在肿瘤发生中起着重要的作用，并且正在作为癌症生物标记物进行研究。除了它们的细胞内调节功能之外，当miRNA分泌到细胞外时，可在各种体液包括尿液中发现，外泌体包裹的肿瘤源性miRNA反映了癌细胞的重要活性。通过对尿液外泌体miRNA的评估提供了一种前列腺癌诊断的全新的、高特异的方法，这是对可靠且经济的外泌体分离方法发起的挑战。

作者首先从35名前列腺癌患者中获得前列腺癌细胞株，将前列腺癌细胞在无血清培养基中培养五天后，发现可检测到颗粒的平均大小为125nm，符合正常外泌体大小30-200nm的标准（B）。此时作者将前列腺癌细胞用浓度为1mg /ml的角豆蛋白A处理后温育4小时，发现有大的颗粒聚集物（500nm）的形成。从曲线中也可以看到在角豆蛋白A处理前（灰线），颗粒的大小峰值在10nm和100nm左右，而在角豆蛋白A处理后（黑线），颗粒大小峰值明显往右移，出现大的颗粒聚集物。同时，作者在尿液中也有同样的发现（下图），用角豆蛋白A处理后的颗粒比未处理前要大。将尿液用浓度为2mg/ L的凝集素孵育，然后在20,000g下离心90分钟，可得到富集的外泌体，且能将大（600nm）的颗粒聚集物完全去除。

为了验证这些观察到的颗粒是真正的外泌体，作者进行了实验。考虑到在细胞培养基中与miRNA相关的RISC（与RNA沉默相关的蛋白）成分的存在干扰外泌体，用针对Ago2的抗体（EIf2C）检测RISC成分的存在。从左图可观察到PC-3细胞中存在外泌体（TSG101和CD9为外泌体标记），且有Ago蛋白的存在，而通过凝集素诱导PC-3细胞（前列腺癌细胞）分泌的囊泡中富含外泌体。从右图观察到在第一次离心的尿沉渣中可检测到一定量的CD9，在第二次离心的尿沉渣中可明确检测到尿外泌体。Ago2蛋白仅存在于第一次离心的尿沉渣中。可以假定第一次离心导致颗粒聚合物的沉降，其可能截留一定量的外泌体。这也解释了为什么第一次沉渣中能检测到CD9。第二次离心导致了外泌体的沉淀。

作者比较了PC-3细胞中分离出来的总RNA（A）、通过凝集素诱导凝集法分离出从PC-3细胞中分泌出的外泌体的总RNA（B）、尿液第一次离心从尿沉渣中分离出来的总RNA（C）和通过第二次离心，在刀豆蛋白诱导的尿沉渣可能包含的尿外泌体中分离出的总RNA（D）。发现核糖体RNA（18S和28S）在细胞RNA中可检测到，但在外泌体RNA中未观察到，外泌体RNA中富含短分子（200-2000个核苷酸）。第二次离心尿沉渣的RNA峰图与PC-3细胞产生的外泌体RNA峰图相似，但是在从几十到几百个碱基的区域中具有较不明显的峰（D）。这些结果证明凝集素诱导凝集的新方法允许分离尿外泌体特定种类的RNA，其区别于通过培养细胞系外泌体获得的RNA种类。

于是作者比较了前列腺癌患者和健康人尿液外泌体miRNA表达，发现了miR-574-3p，miR-141-5p和miR-21-5p这三个miRNA类型在前列腺癌患者中高表达。

最后，作者对三个选择的miRNA（miR-574-3p，miR-141-5p和miR-21-5p）作为前列腺癌诊断的有效性进行验证。作者通过AUC ROC曲线来评价，从图中可看到尿外泌体miRNA-574-3p的AUC为0.85，miR-141-5p的AUC为0.86，而miR-21-5p的AUC为0.65，说明miR-574-3p，miR-141-5p这两个指标的特异性和敏感性较之miR-21-5p这个指标好。

在本研究中，作者证实了凝集素诱导凝集作为外泌体分离和随后的miRNA分析方法的有效性。在可检测的miRNA中，发现了前列腺癌患者的尿液外泌体中的miR-574-3p，miR-141-5p和miR-21-5p这个panel相对于对照组的显著过表达。因此，通过凝集素诱导的凝集法从尿液中分离的外泌体miRNA与前列腺癌的早期阶段相关。该方法的成本相对较低且方便可行，可应用于临床应用和大型研究项目。