作者：蔺亚妮，汝昆(通信作者)

作者单位：中国医学科学院血液病医院病理科,天津

    随着分子生物学及其相关技术的迅速发展，血液系统肿瘤的诊断已进入“精确诊断”时代。目前血液学实验室中主要的分子生物学平台包括聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术、测序技术和基因芯片等；这些技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，在血液肿瘤的诊断、分型、预后判断、疗效评估、微小残留病的监测及个体化治疗等多个方面发挥了重要作用。我们简要概述分子生物学在血液肿瘤诊断中的应用和进展。

一、急性白血病

急性白血病是一类造血干细胞在分子水平发生异常而导致的分化障碍和凋亡阻滞的异质性疾病。具有相同分子遗传学异常的白血病在致病机制、细胞形态、免疫表型和预后等方面基本相似。融合基因主要通过染色体的易位形成，是急性白血病的一种重要致病机制，融合基因的检测已成为急性白血病诊断和分型的重要依据。ＡＭＬ１-ＥＴＯ、ＰＭＬ-ＲＡＲα、ＣＢＦβ-ＭＹＨ１１等是急性髓系白血病（ＡＭＬ）最常见的融合基因，可据此进行诊断和分型，当患者出现以上３种重现性遗传学异常时，即使原始细胞＜２０％，也诊断为ＡＭＬ；Ｂ系的急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）中较常见的融合基因包括ＢＣＲ-ＡＢＬ、ＴＥＬ-ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ-ＰＢＸ１、ＭＬＬ-ＡＦ４和ＭＹＣ-ＩｇＨ等；Ｔ-ＡＬＬ较常见的融合基因有ＳＩＬ-ＴＡＬ１和ＲＨＯＭ２-ＴＣＲδ等。此外，许多较罕见的融合基因也被陆续报道,如ＤＥＫ-ＣＡＮ、ＮＵＰ９８-ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８-ＨＯＸＤ１３和ＧＴＦ２Ｉ-ＲＡＲＡ等。

预后危险度分层是制定治疗策略的主要依据，ＦＬＴ３-ＩＴＤ、ｃ-ｋｉｔ、ＮＰＭ１和ＣＥＢＰα的突变已被常规用于对ＡＭＬ进行危险度分层。ＦＬＴ３-ＩＴＤ和ｃ-ｋｉｔ为不良预后因素，而ＮＰＭ１和双突变的ＣＥＢＰα患者大多预后良好。除此之外，近年来发现了更多的基因如ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＳＸＬ１、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＵＮＸ１和ＣＢＬ等突变，大多为ＡＭＬ预后不良的指标。涉及ＡＬＬ预后的基因有ＩＫＺＦ１、ＰＡＸ-５、ＮＯＴＣＨ１、ＦＢＸＷ７、ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＴＰ５３、ＪＡＫ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＨＦ６和ＣＤＫＮ１Ａ等；其中ＩＫＺＦ１突变主要见于Ｂ-ＡＬＬ，与高复发率、不良事件的发生相关；ＮＯＴＣＨ１和ＦＢＸＷ７则是Ｔ-ＡＬＬ常见的突变，二者突变常同时存在，提示预后良好。

微小残留病（ＭＲＤ）检测已被常规用于评价白血病的预后和疗效。目前已有多种分子标志物被用于ＭＲＤ水平检测，包括ＲＵＮＸ１、ＷＴ１、ＮＰＭ１等。

二、骨髓增殖性肿瘤（ＭＰＮ）

作为人类发现的第一个融合基因，ＢＣＲ-ＡＢＬ是确诊慢性粒细胞性白血病（ＣＭＬ）的主要依据。定期监测ＢＣＲ-ＡＢＬ的表达水平，可准确评估其疗效及预后判定。酪氨酸激酶抑制剂（ＴＫＩ）的使用是肿瘤个性化治疗的里程碑，而ＡＢＬ激酶区突变则是ＴＫＩ治疗失败的重要原因，及时检测ＡＢＬ激酶区突变，有助于选择相应的治疗方案。

ＷＨＯ２００８造血与淋巴组织肿瘤分类中将ＭＰＮ分为８类，其中真性红细胞增多症（ＰＶ）、原发性血小板增多症（ＥＴ）和原发性骨髓纤维化（ＰＭＦ）合称为经典ＭＰＮ，长期以来经典ＭＰＮ的诊断主要依赖于骨髓病理的检查。２００５年ＪＡＫ２／Ｖ６１７Ｆ突变的发现，使得ＭＰＮ的诊断取得突破性的进展，尤其是在ＰＶ中的高频率；随后报道的ＪＡＫ２ Ｅｘｏｎ１２及ＭＰＬ Ｅｘｏｎ１０的突变进一步扩充了ＭＰＮ的分子指标，但是仍有４０％～５０％的ＥＴ和ＰＭＦ患者缺乏特异性的分子标志物。２０１３年对ＣＡＬＲ基因突变的研究表明，除少数ＭＤＳ患者外，ＣＡＬＲ基因突变主要见于ＭＰＮ，联合检测ＪＡＫ２、ＭＰＬ、ＣＡＬＲ基因突变，在ＭＰＮ患者中的阳性率可达９０％以上。与ＪＡＫ２突变的患者相比，ＣＡＬＲ突变的ＥＴ和ＰＭＦ患者表现出较低白细胞计数、较高的血小板计数、以及更好的总生存率。ＣＡＬＲ突变的检测进一步提高了ＭＰＮ的诊断水平。

另外一项研究为慢性中性粒细胞白血病（ＣＮＬ）的诊断及治疗带来重大突破。研究人员发现２７例ＣＮＬ或不典型ＣＭＬ患者中，有１６例患者（５９％）存在ＣＳＦ３Ｒ突变，而该突变在其他研究对象中的检出率不到１％，表明这些ＣＳＦ３Ｒ突变为这两种疾病所特有。ＣＳＦ３Ｒ突变包括截断突变和近膜突变两种，分别对多激酶抑制剂Ｄａｓａｔｉｎｉｂ和ＪＡＫ家族激酶的抑制剂鲁索替尼敏感。鉴于ＣＡＬＲ及ＣＳＦ３Ｒ在ＭＰＮ亚型诊断中的高度特异性，Ｔｅｆｆｅｒｉ等建议新的ＷＨＯ分类系统中将二者的检测纳入ＭＰＮ的诊断标准中。

三、骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）

ＭＤＳ的发生和演变是一个累及多基因的多步骤的病理过程，目前发现的参与ＭＤＳ发生发展的基因突变主要包括：（１）表观遗传调节子基因，如ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２和ＡＴＲＸ等；（２）剪接体复合物蛋白编码基因，如ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１和ＺＲＳＲ２等；（３）信号转导相关基因及转录因子编码基因，如ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＵＮＸ１、ＪＡＫ２和ＣＥＢＰα等；（４）其他，如ＴＰ５３、ＮＰＭ１等。其中ＡＳＸＬ１、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＰ５３、ＳＲＳＦ２和ＺＲＳＲ２被认为是预后不良基因。ＳＦ３Ｂ１突变是难治性贫血伴有环形铁粒幼细胞（ＲＡＲＳ）的主要致病基因，突变率高达８４.８％，伴有该突变的患者预后较好；ＴＥＴ２突变最早在ＭＤＳ中发现，且是ＭＤＳ中突变率较高的基因，目前ＴＥＴ２突变对ＭＤＳ预后的影响尚有争议，有待于通过大量的病例进一步验证。

四、淋巴瘤

淋巴瘤是病理诊断中的一个难点，部分病例表现复杂，单纯通过形态学和免疫表型很难准确鉴别，而一些特异性的遗传和分子水平的改变则可帮助诊断及进一步分型。淋巴瘤的形成是由于淋巴细胞成熟阻滞于某个阶段发生克隆性增生，因此全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）基因重排，即单克隆性重排。需要注意的是，克隆性的增生并不一定就是淋巴瘤，当患者存在免疫缺陷（先天性、移植后、人免疫缺陷病毒感染）、自身免疫性疾病、ＥＢ病毒感染性淋巴组织增生性病变、良性单克隆性γ球蛋白病、良性皮肤Ｔ细胞增生性病变等时也可检测到克隆性的改变。另外，Ｉｇ和ＴＣＲ基因并不局限于Ｂ和Ｔ细胞谱系，存在着谱系交叉，特别是在原始淋巴细胞性肿瘤中。ＮＫ细胞目前没有特别理想的克隆性标志物，虽然杀伤细胞免疫球蛋白样受体（ＫＩＲ）家族中的ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ和ＣＤ１５８ｅ的限制性表达是ＮＫ细胞克隆性的标志，但和ＣＤ１５８家族的复杂性相比，目前有限的ＣＤ１５８抗体不足以用于临床诊断。

霍奇金淋巴瘤（ＨＬ）是治愈率较高的一类肿瘤。研究证实ＨＬ中存在ＪＡＫ-ＳＴＡＴ和ＮＦ-ΚＢ信号通路的激活。全基因组测序的结果发现两个编码ＪＡＫ-ＳＴＡＴ信号通路调控因子的基因发生突变，分别是ＳＯＣＳ１和ＰＴＰＮ１。此前的研究已经证实ＳＯＣＳ１是ＨＬ中一个重要的肿瘤抑制基因；ＰＴＰＮ１突变见于２０％的ＨＬ患者，该基因的沉默可引起下游靶基因的过度磷酸化及过表达。这些基因的鉴定有助于进一步发现ＨＬ的特殊标志物。

根据基因表达谱的特点，弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤（ＤＬＢＣＬ）分为三类：生发中心Ｂ细胞样的ＤＬＢＣＬ（ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ）、活化性Ｂ细胞样ＤＬＢＣＬ（ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ）和原发性纵隔大Ｂ细胞淋巴瘤（ＰＭＢＬ）。相对与预后较好的ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ，ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ的一个主要特征就是基因突变（如ＣＡＲＤ１１）导致ＮＦ-κＢ信号通路的持续激活。通过全基因组测序，目前已经鉴定了许多与ＤＬＢＣＬ相关的基因，主要涉及Ｂ细胞功能（ＢＣＲ、ＮＦ-κＢ、ＮＯＴＣＨ、Ｔｏｌｌ样受体和ＰＩ３Ｋ信号通路）、免疫调节、细胞周期／凋亡或表观遗传调控。ＭＹＤ８８是ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ中频率最高的突变，约为３０％；ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ中最常见的突变基因是ＥＺＨ２。ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ和ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ共同存在的突变基因包括参与染色质甲基化的基因（如ＣＲＥＢＢＰ和ＥＰ３００）、ＭＬＬ２和ＦＯＸＯ１等。Ｌｏｖｅ等首先完成了对Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴瘤基因组的测序，通过与ＤＬＢＣＬ基因组比较，除了特征性的ＭＹＣ基因以外，还鉴定了７０个重现性突变基因，其中可促进细胞周期进程及增殖的ＩＤ３基因突变出现在３４％的Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴瘤患者中，而在ＤＬＢＣＬ中未检测到。这一发现为Ｂｕｒｋｉｔｔ的鉴别诊断及治疗提供了重要依据。

套细胞淋巴瘤（ＭＣＬ）的一个标志性改变为ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１的易位。新近学者发现，ＭＣＬ中频率较高的突变基因除了包括已知的ＣＣＮＤ１外，还有ＡＴＭ、ＴＰ５３、ＭＬＬ２，以及编码抗凋亡蛋白的基因（ＢＩＲＣ３、ＴＬＲ２）和参与染色质修饰的基因（ＷＨＳＣ１、ＭＬＬ２和ＭＥＦ２Ｂ）等。在慢性淋巴细胞性白血病（ＣＬＬ）的研究中，Ｗａｎｇ等通过对ＣＬＬ进行大规模平行测序，确认了９种基因突变的出现频率显著增加，分别是ＴＰ５３、ＡＴＭ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、ＳＦ３Ｂ１、ＺＭＹＭ３、ＭＡＰＫ１、ＦＢＸＷ７和ＤＤＸ３Ｘ，这些新发现有助于进一步对ＣＬＬ进行分类及预后评估。

２０１１年ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突变的发现，开拓了毛细胞白血病（ＨＣＬ）诊断及靶向治疗的新时代。随后的研究证实，ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ仅见于典型的ＨＣＬ，而变异型ＨＣＬ及表达ＩＧＨＶ４-３４的ＨＣＬ缺乏ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突变；ＨＣＬ中除了ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突变外，在ＢＲＡＦ第１１外显子上还鉴定了２个新的突变点（Ｆ４６８Ｃ和Ｄ４４９Ｅ）。因此对于ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ阴性的ＨＣＬ，还应检测ＢＲＡＦ第１１外显子。新近有学者发现，ＭＹＤ８８ Ｌ２６５Ｐ突变广泛存在于华氏巨球蛋白血症（ＷＭ）患者，而在多发性骨髓瘤、边缘区淋巴瘤及ＣＬＬ等中无表达或罕见表达。因此，ＭＹＤ８８ Ｌ２６５Ｐ成为淋巴浆淋巴瘤诊断的重要依据。

虽然外周Ｔ／ＮＫ细胞淋巴瘤的诊断和分类很大程度上依赖于免疫表型，但根据现有的免疫表型，仍有４０％～５０％的外周Ｔ细胞淋巴瘤不能被鉴别，被归类为非特殊类型外周Ｔ细胞淋巴瘤（ＰＴＣＬ-ＮＯＳ）。Ｉｑｂａｌ等利用基因表达谱对３７２例ＰＴＣＬ患者的标本进行了分析，其中５５例ＰＴＣＬ-ＮＯＳ患者通过分子标记被重新归类。此外，根据基因表达谱差异，还将１２１例ＰＴＣＬ-ＮＯＳ患者分为两个亚型，其中４０例患者（３３％）高表达ＧＡＴＡ３，与预后不良高度相关；另有５９例患者（４９％）高表达ＴＢＸ２１。

尽管在血管免疫母细胞淋巴瘤（ＡＩＴＬ）患者中报道存在ＴＥＴ２、ＩＤＨ２和ＤＮＭＴ３Ａ的突变，但是这些基因突变同样存在于其他的髓系肿瘤中，不具有特异性。全外显子组测序的结果发现６８％的ＡＩＴＬ患者检测到ＲＨＯＡ Ｇ１７Ｖ突变，而在Ｂ细胞恶性肿瘤及髓系肿瘤中未见该突变，提示ＲＨＯＡ可作为ＡＩＴＬ的特异性分子标记物及治疗靶点。

肠病相关性Ｔ细胞淋巴瘤（ＥＡＴＬ）分为１型和２型，２型诊断比较困难，常常与１型及其他发生在肠道的ＰＴＣＬ相混淆。２０１３年Ｔａｎ等发现了一种新的分子标志物ＭＡＴＫ，在２型ＥＡＴＬ患者中高表达，从而有助于２型ＥＡＴＬ的准确诊断。

２０１２年Ｋｏｏ等的研究为ＮＫ细胞淋巴瘤的诊断和治疗带来新的希望。该研究同样采用全外显子组测序技术筛选出分子靶标ＪＡＫ３，后续的验证实验发现３５.４％患者存在ＪＡＫ３突变；同时ＪＡＫ３的突变使得ＮＫ细胞淋巴瘤的细胞系能够在缺少必需生长因子白细胞介素（ＩＬ）-２的条件下也能生长，这意味着该突变引起了ＪＡＫ３的特异激活，使得ＪＡＫ３有望成为一种可能的药物靶标。

随着第二代测序的广泛应用，必然会发现越来越多的分子标志物及治疗靶点，从而使分子诊断技术在血液肿瘤诊治中发挥更加重要的作用。但是如何规范化应用分子诊断技术以及相应的分子病理实验室的质量体系的建设，依然是我们所面临的挑战。

参考文献（略），有需要请查看原文章。

本文转自《中华病理学杂志》ChineseJournal of Pathology--2015年8月第44卷第8期