钟文昭，雷源源，吴一龙

广东省肺癌研究所，广东省人民医院

《循证医学》杂志，2016年2月，第16卷第一期

1引言

        百年前，爱因斯坦凭借着超人洞察力提出广义相对论并预言引力波的存在，却终生未能证实；而汇集了全球顶尖科学家的LIGO（Laser Interferometer Gravitational-Wave Observatory）团队在90年代初开始在美国华盛顿州建立观测站，用激光编织的巨网，倾听到来自宇宙深处不同方向的引力波信号。

同样的百年故事也发生在一批埋首于人体幽微细小处的医学家中。

1869年，澳洲医生Ashworth从一例转移性肿瘤患者血液中观察到从实体瘤脱落入血的肿瘤细胞，把它命名为循环肿瘤细胞（Circulatingtumor cells，CTCs），为其后Paget的“种子土壤学说”提供了重要依据。

直至1983年，人类才发现了能够捕获CTC的磁珠。历经20年，CTC检测系统Cellsearch正式获得美国FDA批准用于转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌临床检测；

近30年后的2012年，CellSearch系统获得CFDA进口器械注册。敏锐的学者开始意识到液体活检在肿瘤早筛、辅助诊断、术后随访、疗效评估、耐药监测等潜在的临床和科研价值。   

进入2015，基因测序行业元年，国家卫计委一系列政策利好。风乍起，吹皱一池春水，起于青萍之末。风起的池塘，液体活检在资本护持下风起涌，会把池塘变成惠及患者的江河蓝海，还是野蛮失控生长的商战蓝藻池？

2 液体活检之前生今世

        2015年，MITTechnology Review发布的年度十大突破技术（BreakthroughTechnologies 2015）, ASCO年度进展(Clinicalcancer advance 2015)对未来十年的期许，液体活检均榜上有名。

        液体态活检是一种非侵袭性的检测技术，检测由原发肿瘤或转移灶释放入血液、尿液甚至唾液等体液的循环肿瘤细胞（CTCs）、游离DNA（ctDNA）、小分子RNA（micoRNA）或长非编码RNA（LncRNA）等。与传统的组织活检相比，革命性的液体活检具有一些理论优势：创伤小、可重复性、均化异质性、实时判断疗效，并随肿瘤的发展而动态调整治疗决策。目前研究较为成熟的液体活检技术主要是CTCs和ctDNA。   

        由于检测手段的局限性及循环肿瘤细胞的极低频，长期以来液体活检并未发挥实质性的作用。从发现CTCs至今的一百多年里，科学家像一支不知疲倦的侦察奇兵，即便只是肿瘤细胞路过的遗落信息甚至死亡的残骸，也要探寻出变异密码。这就是目前液体活检技术的两个主要方向：CTC和ctDNA。

超过270个临床研究就中用到循环肿瘤细胞（CTCs）作为替代biomarker , 但是迄今为止，CTCs的检测并没有纳入肿瘤诊疗的常规实践¹。CTCs的分离技术制约着人们对CTCs生物学特性的认识和临床应用的发掘。近年来CTCs的分离技术发展迅速，不同方法各有利弊，总体上可以归纳为两类一类是EpCAM或细胞表面biomarker依赖的方法，另一类是非细胞表面biomaker依赖的方法。获得FDA批准的CellSearch技术是第一类方法的代表，虽然CellSearch系统已在临床上广泛应用，并被美国国家医保Medicare所认可。但该系统属于第一代CTC技术，获得的CTCs，纯度低，且是固定后的死亡细胞，很难进行下游的检测。在此基础上发展的微流体芯片包被EpCAM抗体的检测技术被证实能够显著提高CTCs的检出率，。尽管在此基础上发展的微流体芯片包被EpCAM抗体的检测技术被证实能够显著提高CTCs的检出率，但是，越来越多的研究证实，CTCs经历了上皮细胞间质转化（EMT），与原发灶肿瘤细胞比，丢失了上皮表面粘附分子的表达。而上皮粘附分子又是CellSearch系统主要的捕获靶标。因此，CellSearch在肺癌中的CTC检测结果并不尽如人意。而第二类分离技术并不依赖特定的细胞表面biomarker，而是利用 CTCs的固有属性，如细胞大小，变形能力，电介质极化率，结合/不结合WBCs阴性筛选方法^8-9。避免了细胞表面标志物引起的偏倚能够高通量的捕获经历EMT的CTCs。但是，由于 CTCs的异质性很强，使得基于CTCs物理属性的分离技术也存在一定局限性。近来，一些新的整合平台被用于CTCs的分离，例如一套整合装置结合决定性侧方位移和亲和富集¹⁰。此外，目前没有任何一种技术能够满足所有的CTCs后续检测，所以，依据后续检测的目的选择合适的分离方法也很重要。但无论是在技术还是市场方面均处于早期阶段，尚没有统一的标准，目前还很难判断哪一种技术路线将成为行业标准。

另一方面，ctDNA检测也成为临床探索的热点。由于肿瘤特异性的ctDNA并不存在于正常细胞中，他们为癌症检测提供了一种十分敏感和特异的方法，基于突变检测技术的特异性和敏感性的提高以及二代测序技术的成熟，能够进行微量样本检测，其临床应用的可行性甚至超越CTCs。但是在循环肿瘤标志物中，ctDNA与CTC因其来源不同、评价标准不同、生物学特征不同，两者可能侧重于不同方面的临床应用。CTC在精确反映肿瘤细胞血循环微转移中具有显著优势，可以有效评估肿瘤的发生发展状态，因此在早期筛查、辅助诊断、复发监测及疗效评估上具有独特地位。而ctDNA则更侧重于反应肿瘤细胞内DNA的变异情况，因此其在治疗决策（驱动基因检测）及靶向耐药监测中发挥重要作用。从技术角度，同时检测CTC与ctDNA技术上可行，从临床角度，同时检测CTC和ctDNA所得到的信息可能是互补的。两种液态活检技术共存可能是未来的发展方向。总的来说，保证特异性前提下的高敏感度、便于临床应用、可重复性好是CTC与ctDNA检测技术的三个重要评判标准。

3蓝海：来日之可期

        敏感的投资者们早已捕捉到这一风向标，海内外液体活检市场加速崛起。JP摩根和高盛将液体活检细分为早期筛查、诊断分型、药物伴随检测、患者病情监测4个领域，预测市场潜力将达千亿级。这个乐观预测的基础源于大数据提供的时代背景和市场容量。基因测序应用领域的下一个爆发点将是肿瘤市场。随着测序技术的进步、样本的积累，肿瘤领域的基因测序市场将加速发展。我国正面临着降低癌症发病率和提高癌症生存率的双重挑战，肿瘤患者中,适合使用液体活检技术的肿瘤病人至少为542万人，占比72%。该技术在未来5年至10年的市场渗透率将达50%。

        回归到肺癌的诊疗上，液体活检技术已渗透到肺癌的精准治疗中：以外周血ctDNA/CTC为样本，进行EGFR突变和ALK融合等治疗驱动性靶点检测；在EGFR-TKIs用药期间，动态监测血浆EGFR突变的丰度变化预测患者疗效；在EGFR-TKIs耐药患者中，检测血浆耐药基因T790M的丰度以制定后续治疗策略。可以说，液体活检为肺癌的靶向治疗建立了实时、动态、定量的驱动基因检测体系，与精准医学的思路契合，潜能巨大。技术领先的公司如Cynvenio、Biocept、AdaptiveBiotechnologies等已经获得了美国FDA第三方诊断实验室的认可，也显示出监管机构对液体活检技术临床价值的认可。与此同时，中国CFDA 也批准首个肺癌循环肿瘤细胞检测（靶向 PCR CTC）技术正式应用于临床，或将应用于早期肺部结节或的辅助诊断、手术后复发监测和晚期患者疗效评估。

       乐观预期下，资本对液体活检表现出格外青睐。以Illumina公司为例，融资1亿美元成立新公司Grail，致力于开发“滴血验癌”的早筛试剂盒。获得8000万美元融资成立的CodiakBioSciences，竟是以当年6月份在《自然》杂志上发表的成果为基础。新技术从学科刊物到实体经济转化速度仅几个月时间，让人咋舌。

不过，争相进入蓝海的热潮里也有冷静声音。技术进步与医保覆盖将是接下来打入这个市场最大“鸡血”，但恰好这两项也是目前最大的制约。由于我国地域广阔，区域间的医疗水平差异很大，医保经费紧张，短期内是不太可能覆盖这种新的检测技术。另外，海内外投资机构也认为，该技术还处于早期阶段，从技术成熟到最终实现其市场潜力还需要5-15年时间。

4 蓝藻：未来尚未来

池塘生春草，园柳变鸣禽。本是春意盎然好时节，但若池塘内是随风潜入夜、悄然野蛮生的蓝藻，将带来生态链的隐忧甚至灾难。蓝藻在铺满水塘前8天，仅占池塘的1/256，细微到无法觉察。然而，8天时间，1/128、1/64、1/32、1/16的指数扩张，它已悄然间占领整个池塘。

对于风生水起的液体活检，学界与投资界各怀“蓝藻之忧”。2015年9月10日，加州公司PathwayGenomics在新闻发布会宣布推出CancerIntercept^TM ——首个用于高危人群癌症筛查的液体活检试剂盒。然而短短10天后，Pathway即遭到美国FDA的警告。在此之后，FDA还叫停了另一家硅谷公司Theranos的疾病滴血检测服务。

缘何吸引眼球的新技术未能得到监管部门的肯定？在肯定液体活检重要意义的同时，我们也应该看到，新技术在真正步入高级别临床证据支持前尚面临诸多挑战。这也是“蓝藻之忧”的第一个层面：在技术尚未完善和标准化之前，野蛮生长的产业也许会带来区域性的失控。

第一，技术层面。一方面，CTC和ctDNA检测手段有待进一步提高。CTCs仅少量存在于外周血，且异质性很大，所以CTC的分离技术还面临着很多挑战，目前尚未找到特异的CTCs的表面标志物，所以依赖表面标志物的分离策略难以避免假阴性的出现，多种生物、物理技术被用来分离CTCs，使得CTCs的得率有了很大的提升，但是不同技术的原理不同，导致分离得到的细胞也各异，我们对CTCs的认识还处于盲人摸象的阶段，改进和规范化CTCs的分离技术显得至关重要。目前ctDNA检测常用驱动基因的检测，如外周血EGFR突变检测，尽管具有高的特异性，但是敏感性徘徊于50%~70%左右，成为ctDNA检测临床应用的瓶颈。

另一方面，CTC和ctDNA的诊断价值还需要更多的研究去验证。目前，CTC在临床上的使用还局限在术后或晚期病人计量外周血中CTCs的数量，预测预后，CTCs在早期患者中的研究很少，所以CTCs能否用于实体瘤早期诊断还不明确；CTCs表现出很大的异质性，经历了EMT的CTCs，它的表型和基因型是否能准确复制原发肿瘤，如何通过对CTCs的特点分析来指导个体化治疗还有待进一步研究。同样，明确EGFR-TKIs治疗过程中ctDNA中敏感和耐药基因的动态变化规律还需要更多的临床数据； ctDNA是否能用于癌症筛查还需要解决以下疑问：首先，增加检出灵敏性的同时也增加了基因杂音的干扰，从而导致了假阳性的增加；其次，不是所有的癌症都与离散的和一致的早期基因突变有关，很多癌症在疾病的任何阶段以意想不到的方式产生多种突变；此外，不是所有的肿瘤都会以相同的方式向血液中释放ctDNA；最后，任何新的诊断检测必须经历临床验证，这是常规获批的必要步骤。

 第二，医学伦理层面。尚不成熟的技术推向市场带给大众的是恐慌多于福祉。近年来，肺癌的流行病学谱已发生了迁移，不吸烟、年轻、女性患者比例逐年增高。原来单纯以年龄和吸烟状态作为危险因素定义的依据远远不够。其次是如何取得早筛和过度诊断治疗的平衡。如果我们穷尽各种检测手段，仍然没有发现可见肿瘤，是否需要对这部分人群进行后续的随访复查？筛查本身的并发症，患者的精神忧虑和经济负担又如何衡量？

尽管风险重重，前景仍让企业和研究者对液体活检爱不释手。“若不赶紧跑马圈地，不知不觉之间池塘就会被蓝藻占领，再无空间”，这也成为另一种“蓝藻之忧”。回报越高的领域，风险也越高。据MIT商业评论报道，FoundationMedicine为了开发体液活检已经花掉了近2亿美元，现在仍在以每季度数百万美元的速度消耗；其次，2013年美国最高法院规定基因作为一种自然存在的事物，不能被申请专利；现在这一规定已经延伸到了体液活检。巨额的投入，研发的风险，最后也许是失去了专利的保护，给企业提出了更高的挑战。此时，只有研发出最合理的检测手段和运营策略，才能成为行业的佼佼者。技术仍然成为整个领域里最大的掣肘，同时也是最大的催化剂。

5 规范与精准同行

在此，我们必须对FDA的警告拍手称赞。对于临床研究者而言，液体活检这一新技术既是机遇也是风险，需要扶持和宽容，更需要符合伦理、合理引导、限定范围和有效监管。我们需要在科学性和商业性、创新实践和规则制约之间寻找平衡。对前景不明朗的研究方向，研究热情靠什么支撑下去？是兴趣，以探索未知的好奇心；是合作，来自不同的专业背景的共赢，促进新技术的良性循环。

期待三月羊城十三届中国肺癌高峰论坛：“精准与规范同行：NGS和液体活检步入临床”。