诊断细胞学是是病理学的一个重要组成部分，结合运用化学、生物化学、分子生物学技术对细胞内各种不同的靶标进行检测，从而达到定性及半定量分析。FISH技术广泛应用于多学科领域的研究中，在临床细胞学诊断领域更是不可缺少的重要辅助工具，例如，慢性粒细胞白血病骨髓和外周血中BCR/ABL融合基因检测、膀胱癌尿脱落细胞3、7、17号染色体数目及P16基因状态分析、产前及流产羊水细胞或绒毛细胞样本中对13、16、18、21、22、X和Y染色体数目异常检测等。

细胞学多种类样本的处理中，常因缺少标准操作规范，导致实验结果失败，无法诊断，给临床工作带来不便。本篇对临床中常见细胞学样本的处理操作进行整理、归纳，提出适用于大多数细胞学样本的FISH处理标准方案，赶快阅读、收藏吧！

一、样本制备

样本制备的质量是细胞学FISH诊断成败的基础，必须注意！

1、低渗——样本质量的关键

低渗处理凭借反渗透作用使细胞膨胀、染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液。由于不同类型样本的核浆比不同，对低渗的要求也有所不同，如骨髓/外周血的细胞核占的比例高，低渗时间可以短一些，一般建议低渗时间20分钟；尿脱落细胞/羊水细胞/宫颈脱落细胞的核浆比很小，低渗时间相对需要延长，一般建议低渗时间30分钟。

样本需要进行充分低渗，但是避免低渗不足或者过度。低渗是否充分对FISH检测结果影响非常明显，对于低渗不足的样本，后续可以尝试延长消化时间，改善结果，但是对于低渗严重过度的样本，FISH结果几乎不可逆。

示例：

小编提点：

低渗过程要轻柔，避免太大外力导致细胞核破碎。

高速离心时的离心力会破坏细胞形态，推荐离心转速为2000～3000rpm。

小编推荐：

根据不同样本类型，初次试验时可以设置低渗梯度，例如：10min、15min、20min，杂交后镜下观察，选择最适时间进行低渗处理。

2、预固定

在完成样本的低渗后，需要加入固定液进行预固定。低渗后细胞核膨胀，比较最脆弱，进行预固定时，小心缓慢加入固定液。卡诺氏固定液（3：1 =甲醇：冰醋酸）是常使用的细胞固定液，适用于一般组织和细胞的固定，有极快的渗透力，能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性。通常使用室温或低温。因甲醇与冰醋酸（乙酸）能反应生成乙酸甲酯，所以要现配现用。

小编推荐：

卡诺氏固定液（3：1 =甲醇：冰醋酸）预固定10分钟对于FISH后续处理效果将更有益。

3、滴片

质量好的细胞滴片应具备：细胞密度及数目适当，分布均匀。密度过高的滴片细胞互相重叠；密度过低的滴片，细胞量少，均难以做出准确的诊断。当遇到标本细胞严重聚集成团，细胞碎屑或杂质过多（可自发荧光，造成强背景）时，则需要低渗前使用胰酶或胶原酶进一步处理（常用于尿脱落细胞、羊水细胞），使细胞分布更均匀，滴片背景更干净。

小编推荐：

在相差显微镜下观察细胞密度，单视野细胞数量在100～200个为宜。

二、样本处理

细胞片制备完毕，接下来进行样本处理。

2、操作流程：

（1）预处理：

小编提点：

1) 酶消化：除去细胞膜表面的蛋白质、脂类等物质，充分暴露细胞核。如果消化不足（酶浓度低、温度不适合、时间太短），镜下出现云雾状覆盖在细胞上，形成中间较厚、四周较薄的荷包蛋样细胞，独立的细胞核无法暴露，从而降低杂交效率并难以选择细胞进行计数；如果消化过度，则细胞核被损伤，失去正常的圆形完整形状，甚至形成“鬼影”状细胞，核物质丢失，杂交信号弱甚至无杂交信号，无法判断结果。

2) 1%（1×PBS）多聚甲醛固定：能保护细胞核结构，最大限度保持细胞核内DNA的水平，是细胞消化后最常用的固定液。

小编推荐：

预处理快速法：2×SSC洗涤5min，70%、90%、100%梯度乙醇各3min，晾干。适用于新鲜未培养的骨髓或外周血样本，操作更简单、快速。

（2）杂交：

变性，是利用高温将标记的荧光探针和样本内的DNA双链均变成单链，低温时两者依据碱基互补配对原则结合。变性温度不准确或者时间不充足，探针和靶DNA未能充分打开，导致杂交效率低、信号弱甚至杂交失败；

小编提点：

必需确保变性温度准确、恒定且时间充足；37℃杂交反应的最佳时间为10～18小时。

（3）洗涤：撕去封片胶，揭去盖玻片

小编提点：

杂交后洗涤是为了消除一切影响结果判读的因素（如未杂交的探针、非特异的杂交信号和高背景等），确保诊断更可靠，因此必须充分洗涤。

（4）复染：滴加10μl DAPI复染剂至干燥的盖玻片上，反转样本片，使盖玻片分别与载玻片的目标区域接触，反转后轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

附录：主要试剂配制表：