肺癌目前是全球发病率和死亡率最高的疾病之一。2014年世界卫生组织(WHO)发布的《World Cancer Report 2014》显示，全世界每年肺癌新发病例为180万，死亡病例160万，高居所有癌症发病率和死亡率之首。报告同时指出，我国每年肺癌新发病例为67.6万，死亡病例56.5万，在世界各国之中肺癌发病率和死亡率均居第一位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最为常见的组织学类型，约占肺癌总体患者人群的80%~85%^[1-3]。近年来，随着分子诊断技术的快速发展，人们对NSCLC的认识已经从组织水平深入到分子水平，陆续发现越来越多的肿瘤驱动基因。间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因是继表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变后在NSCLC中发现的又一个具有针对性靶向药物治疗的重要的肿瘤驱动基因。针对ALK融合基因的靶向药物——克唑替尼，显著改善了带有这类分子特征的NSCLC患者的生存。然而，正如EGFR突变基础上的EGFR-TKIs治疗耐药不可避免，尽管克唑替尼在ALK阳性患者获得良好的无进展生存和客观有效率，最终还是会面临耐药而治疗失败的命运。目前几乎所有的TKIs在初始治疗后的9~12个月都会出现耐药问题^{[4, 5]}。耐药已经成为TKIs临床应用最普遍的障碍，同时也是提高晚期NSCLC患者生存时间最急需解决的问题。可喜的是，随着研究的不断深入，ALK-TKIs耐药分子机制的面纱被逐一拨开，越来越多地升级药物及合理的治疗策略应用到临床，大大延长了ALK阳性NSCLC患者的生存。本文针对第一代ALK-TKI——克唑替尼，治疗ALK阳性的NSCLC患者引起耐药的机制及治疗策略做一综述。

一、ALK-TKI——克唑替尼的耐药机制

克唑替尼是一种小分子ATP竞争性的ALK抑制剂，它通过抑制c-Met激酶，阻断c-Met信号转导通路，从而抑制ALK融合基因表达、抑制肿瘤细胞生长^{[6, 7]}。NSCLC患者中有3%~7%存在ALK基因融合^{[8, 9]}，常见于不吸烟的年轻腺癌患者，通常于其他驱动基因(EGFR、KRAS等突变)互相排斥^[10]。克唑替尼明显改善了ALK阳性NSCLC患者的预后，客观有效率(objective response rate, ORR)达60%，无进展生存(progression-free survival, PFS)达8~10个月，总生存期(overall survival, OS)显著延长^[11-13]。尽管ALK阳性NSCLC患者应用克唑替尼治疗获益明显，但这部分患者往往在1~2年内出现耐药，并以中枢神经系统的复发进展较为常见^[14]。已经发现的耐药机制主要有以下几种：

(一) ALK耐药突变

克唑替尼治疗ALK阳性NSCLC患者出现耐药问题，约37%归因于ALK继发性耐药突变。这其中又可以分为ALK激酶区突变(28%)和ALK基因拷贝数扩增(9%)。

    1.ALK激酶区突变 ALK激酶区突变是最早明确的耐药机制^{[15, 16]}。不同研究揭示ALK阳性NSCLC继发耐药的患者存在多种ALK激酶区突变，包括：L1196M，L1152R，G1202R，G1269A，1151Tins，S1206Y，C1156Y，F1174C和D1203N等。数量上L1196M略多，它是一种类似于T790M的看家基因^{[17, 18]}。在首例报道的克唑替尼耐药的病例的同一个肿瘤标本中即发现了L1196M和C1156Y的突变。Doebele等^[15]对14例经克唑替尼治疗后出现继发性耐药的ALK阳性NSCLC患者的标本进行荧光原位杂交(FISH)检测，发现三分之一的患者出现了ALK激酶区的二次突变，主要为L1196M，G1269A和C1156Y。同样，Katayama等^[16]对18例克唑替尼获得性耐药的ALK阳性NSCLC患者进行了FISH和免疫组织化学法检测，发现约四分之一的患者出现了ALK激酶区的二次突变，并且在体外实验中证实了这些突变导致了ALK阳性肿瘤细胞对克唑替尼的耐药。

2.ALK基因拷贝数扩增  ALK基因拷贝数扩增首次是在克唑替尼耐药的ALK阳性细胞系中发现的。随后在克唑替尼耐药的ALK阳性NSCLC患者标本中也发现了拷贝数增加。在Katayama等^[16]的试验中，FISH检测18例继发性耐药的患者的标本中也发现了1例患者ALK融合基因拷贝数扩增。同样，相应的体外实验也证实了ALK基因拷贝数扩增可以导致ALK阳性肿瘤细胞对克唑替尼的耐药。

值得一提的是，当ALK激酶区突变或拷贝数扩增时，ALK信号通路常常会被保留，并在肿瘤细胞的生存和耐药过程中发挥一定的作用。因此，更加有效的二代ALK抑制剂也许能够克服这些机制引起的继发性耐药问题。该类型的耐药也被称为ALK占优势的耐药。

(二) 信号旁路的激活

   ALK阳性肿瘤细胞主要通过ALK及其下游信号通路来控制肿瘤细胞的生长和迁移。当克唑替尼阻断该信号通路时，肿瘤细胞会通过一些机制(如转换驱动基因)来激活其他信号通路，取代肿瘤细胞对ALK及其下游信号的依赖，导致肿瘤细胞对克唑替尼的耐药。该类型的耐药又被称为ALK不占优势耐药。这些转换驱动基因中最常见的是EGFR突变或磷酸化，KRAS突变和c-KIT扩增。Doebele和Katayama等^{[15, 16]}的研究均发现，在未接受和已接受克唑替尼治疗的ALK阳性NSCLC患者的标本中均发现激活的EGFR或KRAS的突变。Katayama等^[16]对18例克唑替尼耐药的标本进行IHC检测，发现有17例标本出现EGFR磷酸化，提示存在不同程度的EGFR通路激活。在细胞系的研究中发现，抑制EGFR磷酸化可以恢复耐药细胞株对克唑替尼的敏感性。除此之外，上述研究中，18例标本经FISH检测发现了2例高水平的c-KIT扩增，IHC检测也证实了这一结果。同时通过IHC检测还发现在这些c-KIT扩增的耐药标本的间质细胞中，c-KIT的配体干细胞因子(stem cell factor, SCF)也存在高表达现象。体外实验证实了c-KIT扩增介导的克唑替尼耐药现象需要高表达的SCF的参与，而克唑替尼联合伊马替尼则可以有效抑制这种机制导致的耐药现象。

(三)肿瘤异质性

     NSCLC是基因和细胞异质性最大的肿瘤之一。我们对于肿瘤异质性及其导致有关的耐药问题，仍然缺乏更深入的了解^[8]。目前，我们已经在多种耐药肿瘤中观察到肿瘤的异质性。例如，对同一ALK阳性NSCLC患者的耐药肿瘤标本进行检测，分别鉴定出了两种不同的激酶区突变，而一些被鉴定的肿瘤细胞不存在这些突变。另一个患者的耐药标本则同时检测出了基因拷贝数扩增和突变^{[19, 20]}。但是我们并不知道这些变异是否都存在于相同的细胞内。2014年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)会议上报道了一个关于多发肺结节的NSCLC患者驱动基因的分布情况。研究纳入35名双肺多发肺结节的NSCLC患者，分别检测其驱动基因分布情况，结果发现不同结节的突变驱动基因分别的不一致率达到了68.6%。这些结果都表明：对于NSCLC患者而言，在不同时间和不同空间其肿瘤细胞可能存在不同的驱动基因突变。肿瘤细胞异质性的存在让耐药问题更加错综复杂，要彻底解决耐药问题，首先需要更多地了解肿瘤异质性的起源等问题。

二、克唑替尼耐药后的治疗策略

(一) 二代ALK抑制剂

第二代ALK抑制剂的结构和克唑替尼有所不同，能够抑制ALK继发性耐药突变。临床前研究证实，第二代ALK抑制剂不仅对ALK基因阳性的肿瘤细胞具有活性，而且对已经鉴定出来的多种ALK激酶区耐药突变均具有活性。这些药物包括：Ceritinib(LDK-378)，Alectinib(CH5424802)和AP26113。

1.Ceritinib Ceritinib是瑞士诺华公司研发的二代ALK抑制剂。其体外研究表明：Ceritinib对ALK阳性和表达突变C1156Y的肿瘤细胞均具有良好的活性^[21]。Ceritinib的记录递增I期单臂试验设计入组131例ALK阳性的经过标准治疗失败的进展期肿瘤患者^[22]。试验分为3个组；之前接受过克唑替尼治疗的ALK阳性NSCLC，之前未接受过克唑替尼治疗的ALK阳性NSCLC和ALK阳性的除肺癌之外的其他恶性肿瘤。截至2012年11月8日，共入组130例患者，其中59例为剂量爬坡组，确认最大耐受剂量(maximum tolerated dose, MTD)为750mg/d；后续71例患者为MTD扩展组。在79例对克唑替尼耐药的ALK阳性NSCLC亚组中，ORR为57%。剩余35例未经克唑替尼治疗的ALK阳性NSCLC组中，ORR为60%。在全组114例NSCLC中，中位PFS为8.6个月(95%CI:5.7~9.9个月)。最常见的不良反应为恶心(73%)、腹泻(72%)、呕吐(58%)和疲劳(41%)。最常见的3~4级不良事件为丙氨酸氨基转移酶水平升高(19%)、天冬氨酸氨基转移酶水平升高(10%)和腹泻(8%)。该项研究结果表明LDK378在400~750mg/d剂量范围内显示出较强的抗肿瘤活性(无论其是否接受过克唑替尼治疗)；最常见的不良反应为恶心，腹泻，呕吐和乏力，且多为1或2级，患者耐受性佳。目前Ceritinib已被FDA批准用于进行多项其他II期和III期临床研究。

2.Alectinib Alectinib是一种强效的选择性ALK抑制剂，其效力比克唑替尼强10倍，能有效对抗大多数的ALK激酶区突变^[23]。在日本进行的一项多中心、单臂开放的I/II期研究对未接受克唑替尼治疗的晚期NSCLC患者进行的剂量递增试验，试验中患者每日口服Alectinib两次。I期试验纳入的24例患者每日口服20~300mg的Alectinib两次^{[24, 25]}。在最高最大剂量耐受组未观察到剂量限制性毒性，也未见4级不良事件的报告。因此II期临床研究选取了每次300mg每日两次的用药方案。共计46例患者以推荐剂量进行了治疗，其中43例患者获得客观缓解，ORR达93.5%(95CI: 82%~98.6%)，其中2例(4.3%)为完全缓解。12例(26%)患者出现了治疗相关的3级不良反应，包括中性粒细胞减少和血液肌酸激酶含量升高。5例患者出现了严重的副作用(11%)。中位PFS尚未达到。基于这一结果，日本卫生部、劳动和福利局批准了该药的使用。同样在美国，食品与药物管理局(food and drug administration, FDA)已经批准Alectinib用于克唑替尼治疗后发生进展的ALK阳性NSCLC患者的治疗，并授予该药突破性治疗的称号。

3.AP26113 AP26113是一种新型的ALK/EGFR-TKI双重抑制剂，可强效抑制ALK L1196M突变和EGFR T790M突变^{[26, 27]}。一项开放标签、多中心I/II期临床试验共纳入44例晚期实体瘤病例，37例是耐受现有治疗药物或没有标准治疗的NSCLC。患者每日口服1次的AP26113.与治疗相关的3~4级最常见不良事件为腹泻(5%)。两种剂量限制性毒性出现在240mg剂量组(丙氨酸转氨酶水平升高3级事件)和300mg剂量组(呼吸困难4级事件)。II期临床试验以<300mg的剂量进一步研究，设4个受试群体：ALK阳性NSCLC初治组，ALK靶向治疗后耐药组，耐药EGFR突变型组，其他ALK变异或其他以AP26113为靶点的肿瘤。

综上，第二代ALK抑制剂对于依赖于ALK信号通路的ALK激酶区耐药突变也许是很好的选择。

(二)联合其他治疗

上文提到，不占优势的ALK耐药突变存在其他信号旁路激活的现象。因此，时应用ALK抑制剂和其他信号转导通路抑制剂，有可能改善此类机制导致耐药问题的临床疗效。

1.联合热休克蛋白(heat shock protein 90, HSP90)抑制剂 HSP90是一类称为分子“伴侣”的蛋白质，可帮助新合成的蛋白质形成发挥他们特定生物学功能的正确形状^[28]。体外细胞系研究中发现HSP90的抑制剂ganetespib对ALK阳性的未经过克唑替尼处理或对克唑替尼耐药的细胞系均有活性^{[14, 29]}。一项关于ganetespib的II期临床试验中^[30]，ganetespib单药治疗ALK基因重排的IIIB/IV期NSCLC，患者之前未接受过直接ALK抑制剂治疗。主要终点是ORR，计划招募受试者约100例。目前试验正在进行中，已经报道的结果显示4例获部分缓解的病例全是未经克唑替尼治疗的ALK阳性型。最常见不良反应为腹泻、乏力、恶心和食欲减退。另一种HSP90抑制剂是AUY922^[31]，目前正在进行用于包括ALK阳性NSCLC在内的II期试验。剂量为每周70mg/m2，121例受试者均为复治NSCLC患者。22例ALK阳性病例中，客观缓解7例(32%)，其中3例是克唑替尼耐药者；疾病控制率为59%(未经克唑替尼治疗组为100%，克唑替尼耐药组为36%)。不良事件主要是1~2级事件，包括眼睛不适(77%)、腹泻(74%)和恶心(46%)。其他联合HSP90抑制剂与选择性ALK抑制剂的临床研究正在进行中(NCT 01712217NCT 01579994)。

2.联合其他TKI 既往的研究表明，在ALK阳性NSCLC患者中，5%~8%的ALK阳性细胞并存EGFR突变^{[32, 33]}。在基于亚裔患者的研究中发现，18.6%ALK阳性患者合并EGFR突变；3.9%的EGFR突变患者合并ALK融合。对于这些患者，联合使用EGFR和ALK TKI相对于单独使用任何一种TKI可以起到更好的抑制效果。但是目前该结论多见于病例报道研究，尚缺乏相关的大型临床数据的支持。

3.联合化疗  EGFR突变阳性NSCLC患者对EGFR TKI耐药后，立即停止EGFR TKI治疗可导致肿瘤出现暴发性进展。可能的原因是停止EGFR TKI治疗后，对EGFR TKI敏感的细胞再次快速增殖，导致肿瘤暴发性生长。同理，对克唑替尼敏感的ALK阳性NSCLC亦可出现相似的过程。因此，当该类患者出现对克唑替尼获得性耐药时，在全身化疗同时是否需要继续克唑替尼治疗，尚无确切答案，通过一些前瞻性临床研究有助于回答这一问题。正在设计的SWOG1300研究即是针对ALK阳性NSCLC患者出现克唑替尼耐药后随机分配至培美曲塞联合克唑替尼治疗组。值得关注的是，在这项研究中如果单药培美曲塞治疗失败后，允许患者再次接受克唑替尼治疗。基因此研究，亦能回答“在具有明确肿瘤驱动基因的患者出现获得性耐药时，是继续原小分子靶向药物联合全身化疗，还是先全身化疗，待疾病再次进展后再重新使用小分子靶向药物”这一问题。研究结果将对临床实践具有重要的指导意义。

(三) 继续克唑替尼治疗

有一种很重要的观点认为，对于靶向药物治疗出现获得性耐药的NSCLC患者，耐药往往不完全。因此当疾病进展时，仍有部分肿瘤细胞能够继续被靶向药物所抑制。一项关于继续使用克唑替尼抑制ALK阳性NSCLC疾病进展的研究发现^[34]，克唑替尼治疗ALK+NSCLC患者疾病进展后，继续使用克唑替尼对比未使用克唑替尼，6个月总生存率为76.3%vs 31.2%，12个月总生存率为64.7%vs 32.9%，OS为16.4vs 3.9月。对其总生存的COX生存分析发现，克唑替尼持续使用可以使生存显著获益(风险比：0.27，95CI：0.17~0.45，P<0.0001)。而患者的性别，吸烟史，体力状态评分等对生存均无显著影响。对于具有驱动基因突变的NSCLC患者，在更改治疗方式之前，区分“仅可检测的疾病进展”与“临床显著进展”非常重要。这是由于某些患者虽然出现了局部的、无症状性进展，但与接受靶向治疗之前相比，肿瘤负荷仍能有较好的控制。还有些病人发现疾病进展后停用TKI，出现了疾病暴发性进展。这是给予患者同一种TKI或作用于同一靶点的不同种TKI，疾病可再次获得良好控制。该现象说明TKI仍能抑制对其敏感的肿瘤细胞亚群。因此，区分不同的耐药模式对后续治疗至关重要。

三、结论

    克唑替尼是继EGFR-TKI类药物后又一重要的小分子靶向抑制剂，其对ALK阳性NSCLC患者显示了良好的临床疗效。然而多种原因导致的耐药问题给临床治疗带来了很多挑战。对于克唑替尼耐药机制的深入探讨将有助于我们给ALK阳性NSCLC患者带来更大的获益。当克唑替尼治疗出现疾病进展时，应根据不同的情况制订后续的治疗策略。目前出现的二代ALK抑制剂虽然可以克服第一代ALK-TKI(克唑替尼)的部分耐药问题，但是要从根本上解决耐药问题还有很长的路要走，对肿瘤异质性更深入的研究可能是解决问题的关键。

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