我们在存在 NTRK1 激酶结构域的肺癌组织中鉴定了新型的基因融合状态，NTRK1 基因能够编码高亲和力的神经生长因子受体（TRKA 蛋白）。MRRIP-NTRK1 及 CD74-NTRK1 融合都可以导致结构性的 TRKA 激酶活性的改变，从而发挥癌基因的作用。采用 TRKA 激酶活性抑制剂来治疗表达 NTRK1 融合基因的细胞，可以有效地抑制 TRKA 的自主磷酸化过程及细胞生长。我们在 91 例未知癌基因突变位点的肺癌患者中的其中 3 名患者组织中，采用二代测序的方法及免疫荧光原位杂交的方法有效地证明了 NTRK1 基因融合的存在。

采用口服活性激酶抑制剂克唑替尼或厄洛替尼、吉非替尼等在分别有着 ALK 基因融合或 EGFR 突变的患者当中的效果优于标准方案的化疗。其他的癌基因，包括 ROS1、RET、FGFR1、FGFR2 和 FGFR3 基因融合也在肺癌当中得到了验证，证明了靶向治疗在治疗干预上非常大的潜力。这些癌基因也同样发生在几种其他类型的恶性肿瘤当中，于是这类研究可以将靶向治疗拓展到其他肿瘤治疗的领域当中。

我们发现在 36 个患者当中，2 例存在着框架内的基因融合，这两例都是女性不吸烟腺癌患者，肿瘤组织都存在 NTRK1 基因激酶结构域，可编码 TRKA 受体酪氨酸激酶，但是没有其它潜在的癌基因突变。我们采用 RT-PCR 及全 cDNA 克隆的方法确认了外显子和 mRNA 的表达状态。

在第一例患者组织当中发现，肌球蛋白磷酸化酶 -Rho 交互蛋白（MPRIP）的 5’端被连接至 NTRK1 的 3’端。MPRIP 参与了肌动蛋白细胞骨架的调节，这与肺小细胞癌的某种基因融合状态有一定的关系，可以推断它可能导致 TP53 的早期终止。在存在外源性 MPRIP-NTRK1 cDNA 表达的 293T 细胞中我们发现了这种 RIP-TRKA 融合蛋白的表达（由 MPRIP-NTRK1 编码），这是一种恶性胸膜转移的标本，同时这个患者的肺癌组织起源细胞（CUTO-3）我们也进行了细胞培养。

CUTO-3 细胞正是包含这种之前未定义蛋白 MPRIP，这个蛋白在关键性分子 TRKA 酪氨酸残基中具备着自主磷酸化的能力。MPRIP 有着 3 种卷取螺旋域（CCDs），其中一种可以介导肌球蛋白磷酸化的相互作用。ALK、ROS1 和 RET 融合基因的伴侣经常包含 CCD，被认为有着介导二聚体形成和催化随后激酶结构域活性的作用；于是，很可能包含着 MPRIP-NTRK1 的 CCD 都有着相似的功能。第二例患者组织内存在 CD74-NTRK1 基因融合。CD74 编码主要的组织相容性复合物（MHC）二型恒定链，是一种已知的激活 ROS1 的融合伴侣，同时 CD74-TRKA 蛋白的融合被推测定位在细胞膜上。

我们采用了一种免疫荧光原位杂交（FISH）的方法来检测 NTRK1 基因内染色体的重排。这些探针的杂交显示出包含着 MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1 基因融合患者组织中 5′及 3′端明确的分离，但是从这些样本的非肿瘤细胞或者对照组织中却没有这样的现象（图 1）。NTRK1 和 TPM3、TFG 或 TPR 之间的融合状态在之前的研究中，证实结肠癌和甲状腺癌中都有存在。尽管 TPM3 定位在 NTRK1 的近端，FISH 也可在包含 TPM3-NTRK1 融合的 KM12 结肠癌细胞系中检测到 5′及 3′端的分离。

采用这种 FISH 检测手段，56 例未检测到癌基因突变的患者进行了 NTRK1 基因重排的筛查，其中 1 例检测到阳性并且最终被证实存在基因融合状态。定量 PCR 证实了 NTRK1 激酶结构域的高表达存在于已知 NTRK1 重排的肿瘤组织中，或 KM12 细胞系中。从癌症基因图谱的转录组分析中，发现 230 例肺腺癌组织中并未检测到 NTRK1 的融合。近期一项 87 例肺腺癌组织的转录组分析，鉴定了一系列之前未定义的基因融合，却不包括 NTRK1 癌基因的融合状态（J.-S. Seo，首尔大学医学院）。

为了正式证实这些突变是致癌性的，我们在其他 3 种常用的评估致癌能力的非肿瘤细胞系中过表达了 MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1 cDNA 结构，它们分别是 293T 细胞，NIH3T3 纤维母细胞及 Ba/F3 细胞，并且通过它们来评估融合基因致癌的特性。我们观察相应大小的嵌合蛋白的表达以及 TRKA 的自主磷酸化过程，就像在 CUTO-3 中所看到的那样（图 1c 和 2b）。

图 1. NTRK1 融合基因的发现和验证。（a）采用二代测序的方法绘制 MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1 融合基因的图谱；（b）FISH 分析 MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1 融合中 5’端和 3’端的分离；（c）TRKA (NTRK1) 融合基因的自主磷酸化过程，以及它们是下游信号通路的关键分子；（d）NTRK1 支持肿瘤细胞的增殖。（e）MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1 的基因融合存在致癌活性。分别采用 RIP-TRKA, RIP-TRKA-KD, CD74-TRKA, EML4-ALK 及空白对照来注射裸鼠，观察肿瘤生长的反应。

引入 NTRK 激酶失活突变并不能导致 TRKA 的自主磷酸化或者增加细胞外信号相关激酶 1 和 2 磷酸化的增加。MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1 可以诱导非 IL3 依赖的 Ba/F3 细胞的增殖，但它们的激酶失活状态并没有类似的效果（图 1d）。

同样，MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1 支持着 NIH3T3 细胞贴壁非依赖性的生长，同时可在裸鼠中生长，CD74-NTRK1 诱导着 NIH3T3 细胞的耐药性特点（图 1e）。KM12 细胞中 TPM3-NTRK1 的敲除可降低细胞增殖，进一步支持 NTRK1 作为致癌性融合基因的作用。

鉴于有着之前靶向治疗的成功经验，如肿瘤有着 ALK 和 ROS1 融合基因的患者采用激酶抑制剂进行治疗等。我们思考是否 NTRK1 融合基因可能在肺癌或其他恶性肿瘤当中提供类似的治疗靶点。因为 ARRY-470 是一种选择性的激酶抑制剂，对于 TRKA、TRKB 及 TRKC 有着毫微摩尔级的抑制活性，但是对于其他激酶没有低于 1000nM 的抑制活性。

除了这些激酶之外，来它替尼（CEP-701）和克唑替尼同样拥有抗 TRKA 的活性。采用 ARRY-470, CEP-701 都可以抑制表达 MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1 融合的细胞生长，以及克唑替尼也可以在较小的程度上抑制 RIP-TRKA 和 CD74-TRKA 的自主磷酸化过程（图 2b）。

在表达内源性 MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1 的 Ba/F3 细胞中，促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活和 AKT 激酶途径也同样可以受到药物的抑制（图 2b）。内源性表达 RIP-TRKA 磷酸化的 CUTO-3 细胞，以及内源性表达原肌球蛋白（TPM3）-TRKA 的 KM12 细胞，同样可以受到这 3 种药物的抑制（图 2c）。

对于有着 NTRK1 基因融合的 Ba/F3 细胞来说，采用 CEP-701 和 ARRY-470 来抑制它们的生长是十分有效的。克唑替尼是一种作用较弱的抑制剂，即使是在 EML4-ALK 或 SDC4-ROS1 融合基因的存在下。克唑替尼对细胞生长抑制作用的温和是与 TRKA 磷酸化抑制的下降以及下游 ERK1/2 的磷酸化密切相关的（图 2b）。

图 2. 药物治疗抑制存在 NTRK1 融合基因细胞的 TRKA 活性、下游信号以及细胞增殖；（a）NTRK1 基因的 RNAi 敲除可抑制存在 TPM3-NTRK1 融合基因的细胞增殖；（b）采用不同浓度的吉非替尼和 DMSO 对照来诱导表达 MPRIP-NTRK1 (RIP-TRKA) 或 EV 融合基因的 Ba/F3 细胞 5 小时，之后检测它们 TRKA 及 ERK 磷酸化的表达；（c）采用不同浓度的药物来诱导表达 MPRIP-NTRK1 融合的 CUTO-3 肺癌细胞，并且采用 western blot 的方法检测下游信号；（d）采用 MTT 的方法来检测表达 MPRIP-NTRK1 的 Ba/F3 细胞对于泛 TRK 抑制剂的效果，ARRY-470 及 CEP-701 有效，而吉非替尼无效。

所有这三种药物都同样可以抑制表达 NTRK1 基因融合 NIH3T3 细胞在软琼脂中的克隆形成。KM12 细胞对于 ARRY-470 及 CEP-701 的敏感性相似，但是对于克唑替尼较弱。ARRY-470 并不抑制表达其他癌基因靶点的 Ba/F3 细胞的增殖，如 EGFR、ALK 或 ROS1 等，对于没有 NTRK1 基因融合的肺癌和结肠癌细胞系也没有效果。所有 3 种药物在 G1 期诱导细胞周期停滞，以及可以诱导 KM12 细胞的凋亡。

上文所说的这个存在 MPRIP-NTRK1 融合基因的患者目前没有标准方案的治疗，也没有临床试验证实 TRKA 抑制剂的有效性，因此，这个患者只能在临床试验之外自愿接受克唑替尼（250mg 每天 2 次）的治疗。这个患者在服药后影像学观察到了小程度的缓解，同时血清肿瘤标记物 CA125 也有所降低，但是疾病在 3 个月后发生了进展。克唑替尼在临床治疗中温和的药效与它在体外实验中我们观察到的是一致的，有可能是由非 TRKA 激酶通路的作用导致的。