上分子生物学课的话，老师会告诉你，qPCR设计原则有以下几点:

1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。

2、不能形成2级结构。

3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。

4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。

5、碱基要随机分布，尽量均匀。

6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8、引物5‘端可以修饰。

9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10、引物3'端要避开密码子的第三位。

11、引物整体设计自由能分布5'端大于3‘端。

12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。

要是我告诉你以上说的大部分都是屁话，你愿意继续听么？

实际的引物设计操作中，如果按照以上所有条款来设计引物，就等着老板来抽你吧。PP5是最好的引物设计软件？错了，PP5只是最好的引物验证软件，用它来设计引物就完蛋了，连Tm值都算不准。

下面来教你怎么设计qPCR引物吧，首先花1分钟找到基因的转录本序列。NCBI上找，如果遇到多转录本，可先用DNA STAR的MegAlign来进行比对，仅选取重合部分，这样就能扩增出所有转录本了。同时注意，仅选取3`末端序列，由于Oligo dT是从PolyA开始反转录的，所以如果片段较长的话，反转录酶可能无法把5`端序列全部给反转成cDNA。

上图为序列搜索，NCBI上，Gene选项，找到基因后找出NM号链接，点开序列

好了，有了序列就要找引物了。不要用PP5了，太老了不好用，且PP5不能兼容Win7的系统。现在推荐你们两款软件，都是超赞的，PP6和AelleID6.0/BD 7.0，有这个在手，基本上就是傻瓜型的操作了。只要会输入序列，就能找到引物了，对引物会有具体的评分，Best、Good、Poor、Not Found，选取Best导出即可，如果是Poor或者Not Found，就调整一下参数如Tm值或引物长度，一般来说都是没问题的。还有就需要调整一下扩增片段长度，qPCR的扩增产物尽量不超过200bp。这三款软件均有破解版，且可以设计Taqman探针和分子信标哦！

上图为PP6界面，你会发觉和BD7.0/AelleID 6.0界面完全一样，点击新建可弹出对话框，贴入序列即可。

引物搜索，注意调整产物长度，Tm值及搜索范围。

引物导出，可直接导出Excel文件，方便实用。