（一） 试剂配制

1. 汽油松节油混合液                     

汽油                                1份

松节油                              1份

2. 碱性品红乙醇液

 碱性品红（basic fuchsin）              5g

 95％的乙醇                           100ml

取小口砂塞瓶盛装，混合后轻轻摇动多次使彻底溶解。

3. 5％的苯酚（phenol）取苯酚置入约50℃的温箱使其溶解，量取5ml与蒸馏水95ml充分溶解。

4. 苯酚碱性品红液

 碱性品红乙醇液                       10ml

5％的苯酚水溶液                      90ml

5. 20％的硫酸（sulphuric acid）

（二）染色步骤

1.组织固定于10％的甲醛液中，常规脱水包埋。

2.切片厚4um

3.切片在汽油松节油混合液脱蜡2次，每次约5～10分钟。

4.用吸水纸将切片周围余液抹干，但切片应保持稍湿润。

5.流水漂洗1分钟

6.滴入苯酚碱性品红液于室温染20～30分钟。

7.流水洗去多余染液。

8.20％的硫酸分化。

9.流水冲洗5分钟。

10.Mayer 苏木精浅染胞核。

11.流水冲洗10分钟。

12.于50～60℃烘箱烘干，经二甲苯透明，中性树胶封固。

（三）结果

抗酸菌（包括麻风杆菌和结核杆菌）呈红色（图3-9），胞核呈蓝色。

（四）注意事项

1.本法改用汽油松节油混合液代替二甲苯作脱蜡剂和不经乙醇浸洗，可保存菌体胞壁类脂质不受破坏，保存菌体壁的完整性，使染色后出现菌量多和染色深，这对菌少的标本更为有利。汽油首选航空汽油，或选汽车用的97号汽油也可。

2.汽油松节油混合液要经常更换，因松节油使用时间稍长，受氧化后变粘稠，用其脱蜡后，染色时整片组织都会着染红色，用硫酸分化也不能脱色。

3.苯酚俗名石炭酸，为无色结晶，如呈红色，则是受到氧化，不应采用。配制5％的苯酚水溶液时，先将整瓶苯酚置于50℃的水浴箱或恒温箱溶解，迅速量取5ml与95ml蒸馏水混合。量取苯酚时，苯酚容易在量筒壁上凝固，应将量筒同时加热。

4.苯酚碱性品红液易出现沉淀，可小心吸取上清液滴染，必要时也可过滤后染色。如在夏季，染20分钟即可，在冬季室温低时则可延长至30分钟。

5.苏木精一定要浅染，否则会影响抗酸菌的颜色，造成对比不清晰。

6.染色后可把切片短时烘干再入二甲苯透明，若经苯酚二甲苯脱水，则抗酸菌易脱色。

二、苏丹Ⅳ法

（一） 试剂配制

1.苏丹Ⅳ染液                       

  苏丹Ⅳ（sudan Ⅳ）                  0.5g 

70％的乙醇                           50ml

丙酮                                 50ml

取一只洁净小口砂塞瓶，先倾入70％的乙醇和丙酮混合，再倾入苏丹Ⅳ，不时摇动，使尽量溶解达饱和，待1天后可用。砂塞瓶要塞紧密封，用时吸其上清液。

2.Mayer 苏木精液

苏木精（hematoxylin）                0.1g

蒸馏水                               100ml

碘酸钠（sodium iodate）              20mg

硫酸铝铵（aluminum ammonium sulphate） 5g

柠檬酸（citric acid）                 100mg

水合氯醛（chloral hydrate）            5g

取一只三角烧瓶盛蒸馏水，稍加温至约50℃，加入苏木精，轻轻摇动使完全溶解。再加入碘酸钠和硫酸铝铵，用玻璃棒搅动使硫酸铝铵溶解，最后加入柠檬酸与水合氯醛，待完全溶解后过滤于小口砂塞瓶内，置4℃的冰箱保存可使用一年以上。

3.甘油明胶

明胶（gelatine）                        10g

蒸馏水                                  50ml

甘油（glycerin）                        50ml

苯酚（phenol）                          0.5g

先将明胶溶于蒸馏水，置于37℃的温箱或水浴箱中一晚使其完全溶解，期间可稍微摇动，然后加入甘油和苯酚结晶，再转入37℃的温箱30分钟，使彻底溶解并混匀即可用。该液于室温呈冻胶状，可保存使用1-2年，用前置于37℃的温箱或温水内待溶解后即可行冷冻切片的脂肪染色封盖。

（二） 染色步骤

1. 新鲜组织低温恒冷切片，根据组织内所含脂肪的多少，切片温度可调解在-20℃～-25℃，若为脂肪瘤，宜调至-30℃。

2. 切片厚6～8um，裱贴于玻片。

3. 70%的乙醇稍浸洗。

4. 苏丹Ⅳ染液浸染1分钟。

5. 70%的乙醇洗去多余染液。

6. 蒸馏水浸洗1分钟。

7. Mayer 苏木精染胞核2分钟。

8. 水洗10分钟，再用蒸馏水洗1次。

9. 用滤纸把组织周围水分抹干。

10. 甘油明胶封盖。

（三） 结果

中性脂肪呈红色（用苏丹Ⅳ染液）（图3-35）、橙红色（用苏丹Ⅲ染液）、橙黄色至橙红色（用苏丹Ⅱ染色）。胞核呈蓝色。

（四） 注意事项

1. 如已经用10%的甲醛液固定的组织作脂肪染色，则不易用低温恒冷切片机切片，需采用半导体制冷切片，厚8～10um，置于一小缸蒸馏水内展开，用玻璃钩把切片捞入70%的乙醇内稍洗，跟着捞入苏丹Ⅳ染液染1分钟，再捞出移入70%的乙醇漂洗，跟着第6步至8步，全过程用捞片染色，至第8步后用玻璃钩把切片捞在载玻片上，抹干周围水分，用甘油明胶封盖。

2. 用甘油明胶封盖的标本，保存时间不长。如需较长时间保持，可在盖玻片的四周与载玻片交界处用中性树胶作一堤围状封固，堤围宽度约2～3mm，但在滴甘油明胶时以不溢出盖玻片边缘为准。

3. 苏丹Ⅳ、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅱ都属偶氮类燃料，不溶于水，稍溶于脂溶剂，易溶于脂肪。他们的分子结构和化学性质基本相似，但呈色稍有不同，在各种脂溶剂中的溶解度亦稍有差异。苏丹Ⅱ又名苏丹橙RR（sudan orange RR），为单偶氮染料，染脂肪为橙黄色，苏丹Ⅲ又名苏丹G（sudan G），为多偶氮染料，染脂肪为橙红色，苏丹Ⅳ又名猩红（scarlet red），也是多偶氮染料，其分子结构比苏丹Ⅲ多两个甲基，染脂肪为猩红色。苏丹Ⅲ和苏丹Ⅳ在95%乙醇的溶解度分别为0.15%和0.09%。可用苏丹Ⅱ或苏丹Ⅲ代替苏丹Ⅳ，染色结果分别呈橙黄色至橙红色或橙红色。

4. 苏丹类染料除用等份70%的乙醇和丙酮混合液外，也可用异丙醇、乙二醇或仅用70%的乙醇作为溶剂。用乙醇丙酮作为溶剂配制的染液溶解度大些，但也会溶脱微小滴状脂质。

5. 凡作脂肪染色的组织都不能采用含乙醇的固定液固定，而必须用甲醛液固定，不能作石蜡切片而须作冷冻切片或石蜡切片。

6. 配制苏丹染液的溶剂都是脂溶剂，有挥发性，配好后的染液一定要密封保存，用前才吸出小量置于有盖的小玻璃皿内进行染色，否则染液易发生沉淀，造成切片污染。

7. 用苏丹Ⅳ 0.3g，苏丹Ⅲ 0.2g溶于等份70%的乙醇和丙酮各50ml，用此染液染出的脂肪滴呈猩红色带橙红色，效果较好。

三、油红O法

（改良Lillie）              

（一） 试剂配制

1. 油红O贮备液

油红O（oil red O）                           0.5g

无水乙醇（absolute alcohol）                  100ml

将油红O和无水乙醇倾入三角烧瓶内，轻轻摇动使其尽量溶解，过滤到小口砂塞瓶密封保存备用。

2. 油红O工作液

油红O贮备液                                   18ml

蒸馏水                                         12ml

充分混合后静置10分钟后使用。

3.70%的乙醇

4.Mayer 苏木精（见本节标题“一、苏丹Ⅳ法”）

（二）染色步骤

1.新鲜组织低温恒冷切片，参阅本节标题“一、苏丹Ⅳ法”。

2.切片厚6～8um，裱贴于玻片。

3.切片于70%的乙醇稍洗。

4.油红O工作液浸染（加盖）5～10分钟。

5. 70%的乙醇稍洗去多余染液。

6.蒸馏水稍洗。

7. Mayer 苏木精浅染胞核2分钟。

8.水洗10分钟，再用蒸馏水稍洗。

9.用滤纸把组织周围水分抹干。

10.甘油明胶封盖。

（三）结果

中性脂肪呈深橙红色，胞核呈蓝色。

（四）注意事项

1. 油红O又名苏丹红5B（sudan red 5B），为多偶氮染料，它比苏丹Ⅳ又多两个甲基，由于它所染的颜色较深，呈深橙红色，故为较好的中性脂肪染料。

2.原法用异丙醇（isopropanol alcohol）配制油红O，改用无水乙醇代替异丙醇更加简单。

3.油红O工作液只能当天使用，用后不能保存。

4.也可用Harris 苏木精染核，但水洗后需用1%的盐酸乙醇分化，使脂滴和胞核清晰。

5.其他可参阅本节标题“一、苏丹Ⅳ法”的注意事项。

四、高碘酸-无色品红法（PAS法）

（一）试剂配制

1. 0.5%的高碘酸（periodic acid）

2. 1mol/L盐酸（hydrochloric acid）

3.无色品红液

碱性品红（basic fuchsin）                             1g

蒸馏水                                                200ml

1mol/L盐酸                                           20ml

偏重亚硫酸钠（sodium metabisulphite）                 1～1.5g

活性炭（activated charcoal）                          2g

配制方法：

（1）取一个500ml的洁净三角烧瓶盛蒸馏水200ml，在电炉上煮沸后取出。

（2）加入碱性品红1g于煮沸后的蒸馏水内，轻轻摇动数分钟使碱性品红彻底溶解，此时溶解为深红色。

（3）待冷却至约50℃时，过滤至另一个洁净三角瓶内。

（4）加入1mol/L盐酸20ml，稍摇动使混匀。

（5）再待冷至25℃左右，加入偏重亚硫酸钠，用塞塞紧，并稍摇动使其与盐酸作用，这时碱性品红的颜色开始变淡。

（6）置于黑暗处作用24小时，此时溶液应呈淡红色或淡稻草黄色。

（7）加入活性炭2g，轻轻摇动1～2分钟后静置1小时，用双层滤纸再过滤到另一个棕色小口砂塞瓶内，此时溶液应完全无色，故称无色品红液，又称Schiff 试剂。

（8）塞紧密封置4℃的冰箱保存待用，用前取出恢复至室温。

4. 0.5%的偏重亚硫酸钠（sodium metabisulphite）  

5.Mayer 苏木精液

苏木精（hematoxylin）                0.1g

蒸馏水                               100ml

碘酸钠（sodium iodate）              20mg

硫酸铝铵（aluminum ammonium sulphate） 5g

柠檬酸（citric acid）                 100mg

水合氯醛（chloral hydrate）            5g

取一只三角烧瓶盛蒸馏水，稍加温至约50℃，加入苏木精，轻轻摇动使完全溶解。再加入碘酸钠和硫酸铝铵，用玻璃棒搅动使硫酸铝铵溶解，最后加入柠檬酸与水合氯醛，待完全溶解后过滤于小口砂塞瓶内，此时溶液呈淡紫红色，置4℃的冰箱保存可使用一年左右。

6. 1%的淀粉酶（diastase）或唾液

7.唾液  用烧杯收集自己的唾液约3ml（必要时可用1%的冰醋酸1滴，滴于舌尖上，促使唾液分泌），取小玻璃棒搅拌均匀，加蒸馏水9倍稀释，再用玻璃棒搅拌1分钟，用双层纱布过滤以除去泡沫。

（二）染色步骤

1.新鲜薄片组织，立即用Gendre液固定3～6小时或Carnoy液固定1～3小时，然后转入95%的乙醇，期间可更换1～2次95%的乙醇。

2.第二天上午转入无水乙醇按常规脱水透明浸蜡，石蜡包埋，切片厚4um。

3.取两张连续切片，分别作A和B记号，然后把B片脱蜡至水（在水中仅稍水洗）。

4.把B号切片浸入预热至37℃ 1%的淀粉酶，于37℃的恒温箱内消化1小时，或用预热至37℃的唾液于37℃的温箱消化30分钟。

5.取出切片稍水洗。

6.在B片消化过程中，把A片脱蜡至水。

7.在A和B两片同时滴入0.5%的高碘酸氧化5～8分钟。

8.流水冲洗2分钟，再用蒸馏水浸洗2次，

9.切片浸入无色品红液（加盖）于暗处作用15～20分钟。

10. 0.5%的偏重亚硫酸钠滴洗2次，每次2分钟。

11.流水冲洗10分钟。

12.Mayer 苏木精浅染胞核约3分钟。

13.流水冲洗10分钟。

14.常规脱水透明，中性树胶封固。

（三）结果

未经消化的A片胞质内阳性的红紫色颗粒为糖原，经消化后的B片应为阴性，胞核呈蓝色，如不作消化对照，组织上出现PAS阳性物质主要有糖原、甲状腺滤泡胶质、消化道、呼吸道和唾液腺的上皮粘液、垂体的嗜碱性细胞、软骨基质、真菌、上皮的基膜、纤维蛋白、胶原纤维、中枢神经系统均呈红紫色（图3-37）

（五） 注意事项

1. 高碘酸和偏重亚硫酸钠液应用小口砂塞瓶盛装塞紧密封置冰箱保存，可使用数月。用高碘酸氧化，比其他氧化剂优越，因为它不会把所形成的醛基进一步氧化。

2. 碱性品红有不同的厂牌和批号，有些纯度较高，可以少加活性炭。若配好的无色品红液仍呈微淡红色时，可再加入一些活性炭摇匀后过滤，这就使溶液无色，这样的碱性品红仍可使用，

3. 偏重亚硫酸钠或钾盐均可使用，但质量一定要纯，要有较浓的刺激性气味，否则作用效果不好就配置不成功。偏重亚硫酸钠用后一定要密封好。

4. 在配置过程中所用的玻璃器皿要求十分干净，一般要用硫酸洗液浸洗过。

5. 不要在蒸馏水沸腾时加入碱性品红，应在停止加热取出蒸馏水待1分钟后才加入，否则沸腾的水蒸气会把碱性品红液喷溅出来。

6. 无色品红液要放冰箱保存，临用前半小时取出恢复至室温，用后又倒回原瓶内放冰箱保存。如此可反复使用多次，至溶液出现淡红色时才倾弃不用。

7. 切片在无色品红液作用的时间随室温而定，夏季若室温高，作用10分钟已足够，冬季室温低，可延长至20分钟左右。

8. 本法如用Hariss苏木精染胞核，则必须经盐酸乙醇分化，否则糖原带紫蓝色而不鲜艳。

9. 用Gendre液固定的组织，糖原呈粗颗粒状，Camoy 液固定的组织，糖原呈细颗粒状。

10. 淀粉酶若存放过久，很易失效，因此，新买回来的淀粉酶要经过试验（消化已知含糖原的切片）才能使用。唾液的消化作用很强，操作虽然麻烦一些，但效果较好。

五、爱尔新蓝（AB PH2.5）法

（一）试剂配制

1.爱尔新蓝液（pH2.5）

爱尔新蓝8GX（alcian blue 8GX）                 1g

蒸馏水                                          97ml

冰醋酸（glacial acetic acid）                   3ml

麝香草酚（thymol）                              50mg

3. 核固红液

核固红（nuclear fast red）                       1g

蒸馏水                                           100ml

硫酸铝（aluminum sulphate）                       5g

麝香草酚（thymol）                              50mg

取洁净三角烧瓶两只，一只盛蒸馏水30ml，稍加热至约50℃，倾入核固红，用玻璃棒轻轻搅动使溶解。另一只盛蒸馏水70ml，倾入硫酸铝，摇动下使完全溶解，与核固红液混合，过滤后加入麝香草酚。

（二） 染色步骤

1. 组织固定于10%的甲醛液中，常规脱水包埋。

2. 切片厚4um，常规脱蜡至水。

3. 爱尔新蓝液（pH2.5）滴染15～20分钟。

4. 流水稍洗。

5. 核固红液复染5～10分钟

6. 稍水洗。

7. 常规脱水透明，中性树胶封固

（三） 结果

  一般黏液物质染成蓝色（图3-39），即含羧基黏液和弱硫酸化黏液物质呈蓝色，强硫酸化黏液物质淡然或不着染，胞核呈红色。

（四） 注意事项

1. 爱尔新蓝液内含3%的冰醋酸，使其PH达到2.5

2. 该液配制后置于4℃的冰箱可保存使用1年以上，麝香草酚作为防腐剂防止真菌生长。

3. 爱尔新蓝的商品有爱尔新蓝8GX和爱尔新蓝8GS,两种皆可用，购买时以选用前者为佳。

4. 爱尔新绿2GX可以代替爱尔新蓝8GX，结果是黏液物质呈绿色。

5. 染胞核若没有核固红，可用0.1%的沙红液代替，但效果没有核固红染的清晰。

六、六胺银法

改良（Grocott）

（一） 试剂配制

1. 1%的高碘酸（periodic acid）

2. 5%的硝酸银（silver nitrate）

3. 3%的六次甲基四胺（hexamethylene tetramine）

4. 六胺银贮备液

5%的硝酸银                                5ml

3%的六次甲基四胺                          100ml

  取5%的硝酸银5ml，慢慢加入到100的3%的六次甲基四胺内，即形成乳白色沉淀，在慢慢摇动中沉淀溶解，溶液变清，用棕色小口砂塞瓶盛装，置于4℃的冰箱，约可保存6个月。

5. 5%四硼酸钠（sodium tetraborate）

6. 六胺银工作液

  六胺银贮备液                                15ml

 蒸馏水                                      20ml

5%四硼酸钠                                   2ml

依次加入，混合后即可使用。

7. 0.1%的氯化金（gold choride）先用棕色小口砂塞瓶配成1%的氯化金贮备液，再以小滴瓶配成0.1%的氯化金，即取1%是氯化金贮备液与蒸馏水1：9稀释即成0.1%的氯化金。

8. 5%硫代硫酸钠（sodium thiosulphate）

（二） 染色步骤

1. 组织固定于Bouin 液中，常规脱水包埋

2. 切片厚2～3um，常规脱蜡至水。

3. 1%的高碘酸氧化15～20分钟。

4. 流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗2～3秒。

5. 切片浸入预热至58～60℃六胺银工作液内（加盖），于58～60℃恒温箱内作用60～90分钟，直至切片在黄棕色的背景中见有黑色反应时，取出切片，蒸馏水洗后在镜下观察，以肾小球毛细血管基膜出现黑色为准。如着色不够深，可用蒸馏水冲洗后再置入六胺银工作液内，以后每隔数分钟取出蒸馏水洗后在镜下观察，至毛细血管基膜显色满意为止。

6. 蒸馏水稍洗。

7. 0.1%氯化金调色2分钟。

8. 蒸馏水稍洗1～2分钟。

9. 5%的硫代硫酸钠处理2分钟。

10. 流水冲洗5分钟。

11. HE染色。

12. 常规脱水透明，中性树胶封固。

（三） 结果

  肾小球囊基膜、肾毛细血管球基膜和肾小管上皮基膜呈黑色（图3-42）。真菌、弹性纤维和网状纤维也呈灰黑色或棕黑色。胞核呈蓝色，胞质呈淡红色。

（四） 注意事项

1. 本法所有的玻璃器皿，应预先用硫酸洗液浸泡过并冲洗干净。

2. 六胺银贮备液配妥后应置于4℃的冰箱内，一般可保存6个月，如置室温仅可保存2周。六胺银工作液仅能使用一次。

3. 这是改良的Grocott法，原法是用铬酸氧化真菌内多糖而暴露醛基，本法用1%的高碘酸氧化以暴露醛基。此法适宜于显示肾毛细血管球基膜。

4. 肾基膜比真菌等较难显色，因而所配置的六胺银工作液比显示真菌的六胺银工作液要浓些，在60℃的温箱内作用时间也较长。

5. 如用水浴箱代替电恒温箱孵育，温度可调低至48～50℃，若调至60℃时，则作用较快，切片很快变黑，而难以掌握，染色缸壁有时也出现银镜反应，导致六胺银工作液变灰黑色而失效。

6. 此法是进行性银浸染，因而应经常取出用蒸馏水洗后在显微镜下观察。肾小管基膜一般比肾毛细血管球基膜显色早，但应以后者为准，肾毛细血管球基膜呈黑色而背景呈淡棕黄色为宜。

7. 本法以用Bouin 液固定为佳，但用10%是甲醛液固定也可。后者在六胺银工作液作用的时间需长些，底色也没有前者清晰。

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